编者按
近些年，产碳青霉烯酶的肠杆菌科细菌（CPE）的出现及传播日益引起人们的关注，尤其是多粘菌素耐药基因（MCR）的出现，为治疗产碳青霉稀酶肠杆菌
感染带来了极大挑战。本文分析评估了在葡萄牙某医院CPE患者中分离到的CPE的mcr-1基因的携带情况，旨在引起有关专业部门和专业人士的关注，共同采取行动遏制mcr的传播。
来自葡萄牙某医院住院患者产碳青霉烯酶肺炎克雷伯杆菌耐药基因分析
摘要
我们描述了一起发生在葡萄牙，由一种产碳青霉烯酶3（CPE）的mcr-1阳性且基因序列45型的多重耐药肺炎克雷伯菌引起的医院
感染暴发事件。 mcr-1位于IncX4质粒中。 我们的数据强调了对mcr-1基因进行系统监测的迫切需要，来帮助医院选择适当的治疗方案。
自2011年以来，欧洲若干国家的住院患者感染产碳青霉烯酶的肠杆菌科细菌（CPE），如肺炎克雷伯菌，且感染率一直在增长，尤其是那些耐药率高的细菌。多粘菌素耐药基因（MCR）的出现尤为引人注意，因为多粘菌素被广泛用作治疗产碳青霉稀酶肠杆菌的最后可选择的药物。在欧洲，已有散发的携带mcr-1基因的
临床CPE分离株的报道。 由于CPE在葡萄牙以惊人的速度增加，我们评估了在葡萄牙波尔图中心医院（一所三级大学附属医院）入院的CPE患者中分离到CPE的mcr-1基因的携带情况。
研究
标本来自2015年10月至2017年7月期间，5，361名入住波尔图中心医院的患者的直肠拭子标本，我们使用Brilliance CRE Agar（Brilliance 耐碳青霉烯肠杆菌琼脂）、Blue-carba 试验筛选碳青霉烯酶阳性分离株并通过实时PCR
筛查碳青霉烯酶基因（Xpert Carba-R； Cepheid， Sunnyvale， CA， USA）（图1，A图）。我们共筛查出283名患者，359份CPE阳性标本，开展进一步检测。 在359株分离株中，252株（75％肺炎克雷伯菌阳性）来自患者的粪便样本，107株（86％肺炎克雷伯菌阳性）来自患者的其他样本（例如血液，尿液）。 然后，我们采用PCR和基因测序方法（5，8，9）从这些分离株中筛查mcr-1，blaCTX-M-I样基因和blaKPC。 我们参照
临床和实验室标准研究所/欧洲抗菌药物敏感性委员会测试指南检测mcr-1基因阳性分离株的药物敏感谱，用肉汤微量稀释法测定阳性菌株对多粘菌素的抗菌药物敏感性，通过纸片扩散法测定对其他药物的敏感性。我们通过多位点序列分型和wzi荚膜分型评估肺炎克雷伯菌菌株间的克隆相关性，并使用PCR评估质粒复制子含量。我们通过Hi Seq 2500测序系统（Illumina Inc.，San Diego，CA，USA）（2×150bp配对读数，覆盖率100×）对分离出的2株肺炎克雷伯菌克隆株进行全基因组测序。采用SPAdes版本3.9.0重新组合阅读并且使用Prokka注明重叠群。我们使用来自基因流行病学中心的工具来评估耐抗菌药物基因和复制子，并且用PLACNETw进行质粒重建。我们通过PCR和基因测序（图2）在靠近复制（pirF）和维持（parA）保守区的IncX4质粒中定位到mcr-1。
我们从2016年9月至2017年2月收集的16例住院患者样本中鉴定出24株产CPE并产MCR-1的肺炎克雷伯菌（图1，B图）。17个分离菌株为定植（即患者的胃肠道细菌），7个来自身体其他部位（3个尿液，2个血液，2个其他体液）（表）。每名患者平均分离到1-4株细菌； 分离的10株定植株均来自重症监护病房。患者（9男7女）年龄范围为50-87岁，其临床病史包括住院时间延长（平均47 d，范围12-151 d）；并发症；并且他们中许多都有手术史，
免疫抑制，或先前抗菌药物使用史（常为B内酰胺类），这些都有利于多重耐药（MDR）mcr-1阳性菌株的感染或定植。患者入院时（14/16筛查的患者中）或入院后的平均15天内（范围3-94）粪便样本为CPE阴性（图1，B组）。 5位患者有1-2次肠外感染时分离出携带MCR-1基因的菌株，有时，分离出先前在其胃肠道中检测到的相同菌株。
患者在检出mcr-1前，并未记录其多患者粘菌素使用和旅行史，但16名患者中的5名在过去的6个月中已经住过院。这些患者均按照临床标准开展了CPE感染治疗，治疗方案为多粘菌素加一种碳青霉烯类抗菌素，辅以磷霉素，替加环素或哌拉西林/他唑巴坦。起初，我们使用了传统的抗菌药物敏感性试验VITEK 2（bioMérieux，Marcy l'Etoile，France）和Etest（bioMérieux）检测多粘菌素耐药性，但由于其结果不可靠，所以我们漏掉了粘菌素耐药性。2017年7月，多粘菌素耐药性监测和CPE菌株的mcr-1筛查才得以开展。
携带mcr-1.1基因的分离株对多粘菌素耐药（MIC 4-8mg / L），产生肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶3（KPC-3），而且大多数（79％）产生CTX-M-15 B内酰胺酶。除了对第三代、第四代头孢菌素和单酰胺类抗菌素耐药（100％）外，分离到的肺炎克雷伯菌菌株也常常对萘啶酸（100%），环丙沙星（96％），替加环素（96％），四环素（92％），妥布霉素（88％ ％），庆大霉素（88％），磷霉素（83％），甲氧苄啶/磺胺甲恶唑（79％）和氯霉素（67％）耐药（见表）。所有分离株都对阿米卡星（肾功能不全患者禁用）和头孢他啶/ 阿维巴坦酶抑制剂（未上市）敏感。
除1株肺炎克雷伯菌外，其余所有菌株都属于序列类型（ST）45，并携带wzi101 / K24，这株克隆株在葡萄牙临床多重耐药肺炎克雷伯菌分离株中很少发现 [5，6]，但已在同一时期产KPC-3菌（不携带mcr-1基因）中循环（L. Peixe，unpub.data）。我们从一名患者的腹壁脓肿的脓液中检测到1 mcr-1阳性的肺炎克雷伯菌（荚膜型KL122）ST1112的分离株（表），该患者先前收集的粪便和尿液样本中分离出携带mcr-1阳性ST45基因的菌株。这2株全基因组测序出的携带ST45基因的肺炎克雷伯菌分离株具有对氨基糖苷类[aac（6'）Ib-cr，aac（3）-IIa]，B内酰胺类（blaKPC-3，blaSHV-1，blaOXA-1），氟喹诺酮类[qnrB66，aac（6'）Ib-cr，oqxAB]和其他抗菌药物[catB4，tet（A）]耐药的基因编码；这2株分离株中的其中1株具有另外的基因aph（4）-Ib，strAB，blaTEM-1B，blaCTX-M-15，catA1，sul2和dfrA14。
所有mcr-1基因阳性分离株中，基因位于IncX4型质粒中（图2）。比较基因组学显示，该质粒（pAN_M1A）在许多不同国家（包括葡萄牙）的多种不同宿主（人类，猪，家禽）和环境中循环。我们从之前调查中的一个≈58-kb IncN-ST15质粒的Tn4401d亚型中确定了blaKPC-3 基因；blaCTX-M-15基因与多复制子质粒IncFIIK-FIA-FIB相关。
我们发现，5.7％（16/283）的住院患者的胃肠道定植有mcr-1阳性CPE，而这些患者中有1.8％（5/283）发生了感染；这与中国的相关报道相似（粪便定植率高达6.2%，感染率为1%）。在中国，仅报道过1次携带mcr-1的临床分离株的暴发[13]，而在欧洲，其发生率低（<1％），而且仅有散发临床病例的报道[3，4]。多粘菌素是重要的最后一种抗菌药物； 多药耐药菌株长时间携带阳性mcr-1基因（特别是出院患者）具有引起继发感染和将基因传播给其他肠杆菌科细菌的风险。值得注意的是，出院时识别无症状CPE携带者是葡萄牙推荐的一种做法，但不是强制性的。
考虑到入院时没有检出CPE，但有可能是医院获得和携带mcr-1的产KPC-3菌株院内播散所致； 然而，我们不能排除也可能来自其他肺炎克雷伯氏菌谱系或大肠杆菌。虽然在葡萄牙由mcr-1阳性菌株引起人的细菌定植率尚不清楚，但曾经在家畜中检测到mcr-1（如在猪中检出肺炎克雷伯菌ST45），提示产MCR-1的肠杆菌可通过食物链传播，且在其他肠杆菌科中广泛播散（8，11，14，15）。
结论
我们从一起与暴发相关联的产碳青霉烯酶-3的多重耐药的肺炎克雷伯菌发现了MCR-1基因。CPE高发生率和多粘菌素的高使用率（2，5，6），以及MCR基因的社区传播，提示在未来还会有类似事件的发生。我们的研究结果强调，要让不同专业人员和医疗机构采取协调一致的行动，来监测并遏制mcr通过人和动物，食物链和环境的播散。
图1 A
图1 2016-2017葡萄牙mcr-1阳性产碳青霉烯酶3肠杆菌感染患者的筛选和检测。 A）流程图显示样本选择的基本原理。首先，我们通过用Brilliance CRE琼脂（Oxoid，Basingstoke，UK）；Xpert Carba-R（Cepheid，Sunnyvale，CA，USA）；和VITEK 2（bioMérieux， Marcy l’Etoile， France）检测患者粪便样品，筛选胃肠道中CPE的无症状携带（即CPE定植）；其次，我们测试了所有患者已有样本的CPE。最后，我们对筛选出碳青霉烯酶的分离株进行mcr-1基因检测，以对最后的样本进行鉴定样本。*约75%患者具有CPE分离株和完整的流行病学和临床数据。？用于筛选mcr-1的最终样品仅包括非重复分离株。对于粪便样本而言，我们认为72小时内采集的，从同一名患者的多份样本中检测到的分离株为重复菌株；对其他类型样本而言，认为从同一时间点采集的同一类型样本中检测到分离株为重复菌株。？从胃肠道或身体其他部位分离到携带mcr-1阳性基因的4名患者。 B）代表16名mcr-1阳性CPE患者流行病学数据的时间轴。 CPE，产碳青霉烯酶的肠杆菌科； ICU，重症监护室； MED，医疗单位； SURG，外科病区；TU，移植病区。
图2
图2 不同来源和不同地区含有mcr-1的 IncX4代表性质粒比对图。含有mcr-1的 pAN_M1A质粒作为参考质粒。最外面的圆圈是参考质粒的基因注释，并显示开放阅读框的转录方向。灰色代表Pil基因位点和其它基因，深蓝色代表相关基因复制，红色代表耐药基因，绿色代表插入序列。用红色箭头指示携带mcr-1的质粒的PCR定位策略。引物P1对应pirF，P2对应 mcr-1（3.3kb），P3 对应mcr-1和P4对应 parA（2.1kb）
表：2016-2017年葡萄牙分离到产KPC-3和MCR-1的肺炎克雷伯菌的16名患者的人口统计学和流行病学数据
CAM，氯霉素； CIP，环丙沙星； FOT，磷霉素； GEN，庆大霉素； ICU，重症监护室； KAN，卡那霉素； KPC-3，肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶3； MCR-1，调动了粘菌素抗性1； MED，医疗病区； MIN，米诺环素； MLST，多位点序列类型； NAL，萘啶酮酸； 奈替米星； SURG，外科病区； ST，序列类型； STR，链霉素； SXT，甲氧苄啶/磺胺甲恶唑； TET，四环素； TGC，替加环素； TOB，妥布霉素； TMP，甲氧苄啶；TU，移植病区。
文献来源：
来源：SIFIC感染官微
版权声明：
本网站所有注明“来源：梅斯医学”或“来源：MedSci原创”的文字、图片和音视频资料，版权均属于梅斯医学所有，非经授权，任何媒体、网站或个人不得转载，授权转载时须注明“来源：梅斯医学”。本网所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系，我们将立即进行删除处理。同时转载内容不代表本站立场。
在此留言
0
