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Nat Rev Neurol:卒中生物标志物和治疗靶标的多组学综述

Tags: 缺血性卒中  生物标志物  更新:2020-6-13

由于血管危险因素的负担日益加重以及突出的人口老龄化问题,导致神经血管疾病的发生越来越普遍。其中,缺血性卒中(脑卒中)是最常见的类型,占到了所有卒中比例的87%。然而目前还没有关于卒中的生物标志物用于临床,这给卒中患者的早期诊断和治疗带来了挑战。高通量技术和生物信息学的快速发展为破译这种复杂疾病的病理生理学提供了新的契机,通过整合多组学技术,可以同时研究数千种蛋白质(蛋白质组学)、基因(基因组学)、RNA(转录组学)和代谢物(代谢组学),进而从分子水平上揭示它们之间的相互作用网络。

在这篇综述中,作者详细介绍了关于卒中病理的知识及其生物标志物的研究现状。另外,本文还总结了蛋白质组学、代谢组学、转录组学和基因组学将为卒中发病机制、治疗靶点和生物标志物的发现提供有用的帮助。

在这篇综述中,作者概述了利用多组学技术帮助发现缺血性脑卒中诊断和预后的生物标志物, 以及它们如何识别治疗干预的分子靶点(图1)。本文研究了近些年在基因组学、转录组学、蛋白质组学和代谢组学方面取得的进展,并讨论了如何通过整合学和系统生物学将来自这些技术的数据结合起来,从而推进对卒中的理解。

一、缺血性卒中的病理生理学

在急性缺血性卒中中,大脑血流量的突然下降会导致神经元和其他脑细胞的氧气和葡萄糖供应的全部或部分减少。其结果是触发多种生理、生化和分子机制,最终导致大量的细胞死亡并改变缺血核的基本神经功能。死亡的脑细胞会释放危险信号,即所谓的损伤相关分子模式(DAMPs)。DAMPs和促炎细胞因子激活初级和次级淋巴器官,导致全身性炎症反应综合征。因此,卒中后的免疫变化不仅局限于大脑,还发生在各种周围器官,包括血液、骨髓、脾脏和肠道。

然而,卒中后的炎症反应是自我限制的,过量的促炎介质也会激活交感神经和下丘脑-垂体-肾上腺轴对称系统。这些系统释放压力激素、糖皮质激素和儿茶酚胺等,从而促进了免疫细胞的凋亡,增加了抗炎细胞因子的产生,如转变增长因子-β(TGFβ),并且抑制了IL-1、IL-8与肿瘤坏死因子(TNF) 等炎性介质的产生。在这些过程中改变的数千个分子中,有些可能是有价值的疾病指标,将有助于缺血性脑卒中的诊断和预后。目前利用高通量组学技术已经识别出了一些有价值的分子。

二、卒中生物标记物的研究现状

虽然血液生物标志物已经在其他血管疾病的诊断中使用了很多年,但是目前还没有一个生物标志物是专门用于诊断卒中的。随着研究的深入,一些具有特定临床适应症的候选标记物已经出现,并可能在不久的将来应用于临床。

表1与未来以生物标记为基础的脑卒中护理相比,当前脑卒中预防和治疗护理标准

1、 急性缺血性脑卒中

对急性脑卒中生物标志物的研究主要集中在两个方面:第一是改善或加快诊断。二是改善临床决策,促进个性化治疗的使用。目前,卒中是通过临床评估和神经影像学诊断的,更快、更准确的卒中诊断技术,如验血,对早期治疗至关重要。在之前的研究中,已经评估了单一生物标志物或生物标志物面板在这种情况下的效用,但其准确性远远低于临床实践的要求。诊断短暂性缺血发作的生物标志物也很有价值,因为许多患者在治疗时已经无症状,所以诊断主要依赖于临床病史。另外,预测治疗反应的生物标志物也越来越重要,因为不同的患者对静脉溶栓和机械再灌注的反应不同。几项研究表明,出血转化与循环基质金属蛋白酶9 (MMP9)水平升高之间存在关联,而MMP9在微血管和血脑屏障完整性中起着关键作用。

2、 其他非急性缺血性卒中

即使患者的基本特征相似,几个月后的卒中后预后也存在差异。许多分子标记与这些结果相关。许多分子标记与这些结果相关。例如,炎症生物标志物如IL-6和肽素的水平对预后的预测价值高于临床变量。然而,除了有助于预测总体预后外,血液生物标志物还可以提供导致不良预后的具体并发症原因的信息。在缺血性脑卒中患者中,尽管进行了广泛的检查,但仍有25% - 30%的患者在没有明确的脑卒中病因诊断的情况下出院。阵发性房颤被认为是这些病人的潜在原因,尤其是那些有不明原因的栓塞性卒中的病人。

3、生物标志物检测的标准化

虽然一些生物标记物可能接近临床阶段,但由于分析前和分析阶段的可变性来源,它们在临床实践中的应用还需要进一步的研究。分析前的来源包括样本的储存条件和时间、冻融循环、生物样本的类型(例如血清、血浆和其他液体)以及健康和疾病情况下生物标志物的生物变异。分析可变性是由与分析方法相关的因素引入的,如分析设计、抗体(用作试剂)或校正器的差异(通常是用于校正免疫测定的重组蛋白或合成肽)。在临床研究中使用非标准化的测定方法可能会造成关于生物标志物价值的不准确结论,并最终导致错误的临床决策。为了解决这一问题,一旦标准化或协调的工作完成,将会重新校准从临床和流行病学研究到金标准参考测量的旧测量方法。这种方法将使荟萃分析产生强有力的结论,以支持临床决策。此外,临床数据的标准化可以使跨试验的数据分析成为可能;这种可能性产生的更大的样本量将为研究亚组提供足够的动力,而这是无法在单个试验中探索的。

三、多组学研究应用于发现生物标记物

以上讨论的大多数脑卒中的生物标记物都是基于潜在的病理生理过程,如炎症、免疫系统反应、细胞凋亡、凝血、纤维蛋白溶解、组织重塑和心脏损伤。然而,技术的进步使得基于大规模筛选过程的高通量技术得以使用,并产生大量的候选分子作为生物标记物进行评估。

在这些基于组学的方法中,蛋白质组学(对整个蛋白质组的研究)仍然是发现新的生物标志物最常用的工具。然而,基因组学、转录组学和代谢组学正在产生越来越有前景的结果,这些多组学方法可能是互补的,特别是如果多个组学方法可以应用于同一患者。

图1 脑卒中研究的多组学方法的示意图

1、 蛋白质组学

蛋白质组学技术的发展使研究人员能够从单个蛋白质的定量研究转向同时鉴定数千种蛋白质。在临床脑卒中研究中,快速发展的蛋白质组学技术已被用于更好地了解疾病的病理生理学,从而识别许多潜在的生物标志物(表2)

缺血性脑的蛋白质组学

在2009年发表的第一个关于脑卒中患者蛋白质组学的研究中,激光显微解剖被用来研究缺血性脑的神经元和血管系统中MMP的表达谱。本研究表明,神经元是卒中后MMP10的重要来源,而血管生成的MMP9和组织抑制金属蛋白酶2 (TIMP2)含量较高。在2018年发表的一项研究中,蛋白质组学的最新进展使我们能够评估神经血管单元的每个组成部分在蛋白质水平上对缺血事件的反应。

卒中后体液中的蛋白质组学

除了对脑蛋白质组学的研究外,还对可获得的体液中的蛋白质表达模式进行了研究,从而更好地了解缺血性脑卒中的病理生理学。2011年,在人类大脑蛋白质组首次被描述的几个月后,卒中患者的大脑细胞外液体蛋白质组的研究也首次发表。

神经血管蛋白组学的巨大进展使我们更接近于发现缺血性卒中的诊断、预后和治疗的生物标志物。然而,目前尚未发现任何一种潜在的生物标记被转化为临床工具。造成这种差异的主要原因是,蛋白质组学的研究是基于一种放之四海而皆准的假设。然而,这一假设是有缺陷的,因为病人对治疗的反应不同是由多种因素造成的,包括基因和个体蛋白质组学。我们也希望生物标志物领域将向精准医疗发展,在选择正确的治疗方法时,个体之间的差异将被考虑在内。在这种情况下,蛋白质组学可以识别成千上万的蛋白质及其相关的翻译后修饰。这使得它成为能够快速发现新的生物标志物的理想策略,并且具有很高的精度和预测能力。以患者为中心的蛋白生物标志物将使患者更好地分层,以便在适当的剂量和最佳的时间进行适当的治疗。然而,大规模蛋白质组学研究需要的患者数量和所需设备的高成本也是阻碍快速临床应用的原因。

2、卒中基因组学

由于脑卒中的异质性,目前已经证明了其基因组学比其他常见的血管和神经系统疾病更为复杂。在以人群为基础和临床为基础的研究中,多代协作取得了重要进展。这项工作对卒中的病理生理学有了新的认识,并为新的治疗方法开辟了新的途径。在绝大多数病例中,遗传风险变异导致了卒中的多因素易感性,而每一种遗传变异只导致卒中风险的小幅增加。

脑卒中基因与治疗策略发展的关系

脑卒中相关基因的鉴定可以在多个方面帮助发现和开发新的治疗靶点和治疗策略,通过破译造成卒卒中险的分子机制,为新疗法的发展提供了信息。另外,加速识别与脑卒中的发生和严重程度相关的基因,并将其作为生物靶点进行测试。这种方法需要广泛的生物信息学分析来识别相关位点中最可能的致病基因,然后进行实验研究。生物信息学方法也可以用来评估一个假定生物靶标的可成药性。

通过使用生物信息学工具来确定已知药物靶点中与卒中相关的基因,揭示药物重组的潜力。例如,MEGASTROKE的研究发现,抗血栓药物靶基因(包括PDE3A)编码用于治疗卒中的抗血小板药物西洛他唑的靶基因。

利用模仿药物作用的遗传变异为药物作用提供遗传支持(例如,与药物靶基因表达增加或减少相关的变异)。据估计,拥有这种基因支持的药物临床试验的成功率是没有这种基因支持的药物的两倍。

通过将卒中分为更同质的亚型,这些亚型可能对特定治疗有不同的反应。卒中亚型的分子标记将通过与其他循环生物标志物相结合的方法得到细化。

通过识别卒中高危人群,使他们成为早期强化预防措施的目标。

图2 遗传变异影响卒卒中险和卒中结局的机制

卒中表观基因组学

与固定的遗传因素相比,DNA甲基化是最常见的表观遗传修饰,它调节基因的表达,具有动态的和组织特异性的特点。表观遗传相关研究为表观遗传因素如何影响复杂疾病提供了强有力的评估。DNA甲基化可以通过调节遗传或环境危险因素来影响脑卒中的发病机制,并且如果表观遗传变化是脑卒中的原因或后果的话,DNA甲基化可以作为脑卒中的生物标志物(两个方向的关联都是可能的)。目前对卒中相关表型的表观基因组的研究仍处于起步阶段,但也产生了具有希望的发现。例如,编码蛋白磷酸酶1A的PPM1A中不同的甲基化模式与阿司匹林治疗的卒中患者的血管复发有关。然而,在不同缺血性卒中亚型之间未发现甲基化的整体差异。DNA甲基化也可以用来估计生物年龄,这是一个独立的预测缺血性卒中的结果,而不考虑实际年龄。

脑卒中基因组学的未来方向

大多数已发表的关于复杂卒中遗传学的研究都集中在常见或低频单核苷酸多态性上,这只能解释卒中遗传可能性的一小部分。其他类型的变异,如罕见的单核苷酸变异或结构变异,还没有得到充分的研究。目前正在通过使用新一代测序技术来解决这一短缺问题,如“精准医疗跨组学”(TOPMed)项目等。

基因研究也应该扩大到包括非欧洲血统的群体,这一步对于加强卒卒中险位点的发现、识别因果变异和基因是至关重要的。最后,卒中的发生及其严重程度是DNA序列以外的因素之间相互作用的结果,包括表观遗传修饰、RNA转录、蛋白质和代谢。因此,将基因组学信息与表观基因组学、转录组学、代谢组学和蛋白质组学数据相结合,将丰富我们对造成卒卒中险和卒中预后的生物学的理解。

3、卒中转录组

转录组学研究的重点是外周血细胞的基因表达和血浆中的RNA作为潜在的生物标志物。RNA具有已知的编码和非编码转录都可以通过微阵列或RNA测序进行评估的优点。所鉴定的RNA可以用第二种方法进行确认,如逆转录PCR (RT-PCR)。这种方法导致了与卒中诊断、卒中病因学和卒卒中险相关的几个转录组的鉴定(表4)。然而,关于RNA在脑卒中的表达的研究仍然很少。初步研究证实,基因表达与microRNAs (miRNAs)和长链非编码RNA (lncRNAs)表达的差异有可能成为脑卒中的生物标志物。它们还提供了对人类卒中生物学的新见解,并可促进卒中的风险分类、诊断和病因学的确定。要将大量的标记物转化为临床实践,还需要对这些标记物进行进一步的评估和验证。

4、卒中代谢组学

脑缺血会引起局部和全身代谢的改变,如细胞能量代谢途径的改变和整体应激反应。这些改变引发了对代谢物是否可以作为评估卒卒中险、定义诊断和识别病因性卒中亚型的循环生物标志物的研究(表5)。相比之下,代谢物对卒中后功能预后的价值还没有得到系统的研究。代谢物是来自脂类、氨基酸、碳水化合物和核苷酸等物质的小分子(通常<1.5 kDa)。已知的循环代谢物的数量为>25,000,但其含量低至约3,000。循环代谢物的组成是基因、表达和环境变化的下游功能,如饮食摄入和肠道菌群的变化。因此,对循环代谢组的分析可以捕获系统水平的信息。此外,代谢物调节关键的生物过程,如细胞信号传递,因此代谢物可以提供有关疾病机制的信息。

为了解释代谢物在极性、电荷和大小上的巨大差异,代谢组学分析涉及到不同的技术,通常以核磁共振波谱和质谱为基础。核磁共振波谱需要最少的样品准备且具有高度的可重复性,但只能检测样品中最丰富的代谢物。基于质谱的方法更敏感,可以检测到数千种代谢物,但更容易发生变异而且价格昂贵及需要更复杂的生物信息学分析。针对感兴趣的代谢物的使用内部标准和方法(有针对性的方法)可以确定特定代谢物的绝对水平。相比之下,由于缺乏内部标准并使用广泛的分析方法来捕获具有不同极性、大小和电荷的代谢物(一种非靶向方法),因此可以对样本中尽可能多的代谢物(包括未知化合物)进行相对定量。

代谢物和卒中的风险

已确定的卒中危险因素,如血脂异常和糖尿病,以代谢变化为特征。因此,直接量化代谢物水平可能是一种比传统的基于危险因素的分类更准确的评估风险的方法。以这种方式对代谢物的研究也能为预防策略提供帮助,如药物或饮食摄入。举个例子,在2019年发表的一项研究中,30个前瞻性观察性的研究(包括68659名患者)是为了研究亚油酸水平之间的关系—主要是饮食ω-6多不饱和脂肪酸和心血管疾病。较高的亚油酸循环水平与较低的心血管疾病和缺血性卒中风险相关,这一发现可以用来提供膳食建议。

用于卒中诊断的代谢物

代谢物被认为比蛋白质更容易透过血脑屏障,因为它们体积更小。此外,代谢物的半衰期范围广泛,这意味着它们的循环水平可以比其他分子实体更早地反映急性发作性疾病。在此基础上,我们进行了多项研究,以确定代谢物是否可以作为诊断缺血性卒中急性期的生物标志物。

总的来说,一些循环代谢物已经确定与卒中风险和诊断相关。然而,相关的代谢物之间存在不一致的情况,这可能是一些研究设计特征的结果。首先,小样本量导致统计能力不足,无法捕捉到数百种被测代谢物之间的真实差异。第二,不同研究采用不同的招募策略,导致纳入的患者组之间存在差异。第三,不同研究之间的采血时间是不同的。最后,在不同的研究中使用了不同的检测平台,如靶向方法和非靶向方法。在未来的研究中考虑这些方法学的混杂因素,加上技术的进步,将使代谢组学更接近于临床应用。

5、整合生物学和系统生物学

所有组学技术的进步都需要开发新的工具,以便分析和解释正在生成的多维数据。许多统计方法已经被开发出来,用于从组学的各个层次独立分析大规模、高质量的数据,但这种单一的分析忽略了不同分子实体之间的相互交流,可能会错过生物学上相关的信息。整合生物学有望为复杂的生物系统提供新的见解,并揭示所有分子水平之间的相互作用网络。无论单个组学水平的变化是大还是小,基于积分的候选生物标志物都具有生物学相关性。变化非常大的候选生物标志物最有可能在临床应用中作为脑卒中的生物标志物,因为较大的变化将更容易建立一个分界点并区分不同的情况。变化较大的候选生物标志物也可以作为治疗靶点。系统生物学正在成为一种更复杂的积分学方法,该方法将多个分子水平的实验数据与计算模型相结合,并将整个系统作为一个整体来处理,以方便识别具有诊断、预后或治疗价值的数据。系统生物学也被设计用来追踪特定分子随时间的相互作用,而不是提供分子关系的静态地图。考虑到卒中的复杂性和异质性,了解这些分子间的相互作用如何随时间演变有助于确定生物标志物测量的最佳时间点或特定药物的治疗时间窗口。

总的来说,虽然综合方法明显提高了知识水平,但将组学数据与表型数据相结合的方法仍需进一步发展。然而,一旦开发和实施,这些方法将能够在设计最佳诊断、预后和治疗策略时优先考虑特定的通路和基因靶点。考虑到卒中是一种复杂的、多因素的疾病,许多生物学过程同时被解除控制,单个分子因子的调节不可能足以减弱或逆转卒中病理的进展。因此,研究工作的重点是确定关键的分子特征,包括一系列对卒中病理有重要贡献的因素,这一过程类似于目前用于治疗癌症的组合疗法的发展。

结论

技术进步促进了组学时代的到来,这使得在不同的分子水平上收集和整合数据信息成为可能。通过组学技术获得的信息将有助于更好地了解脑卒中的病理生理学,为诊断和预后提供新的机会,并将改善对脑卒中患者的管理。上述所有新兴的组学方法无疑将在不久的将来改变医疗实践。虽然还需要实验验证,但多组学方法在脑卒中治疗中的临床应用具有光明的前景。总之,整合系统生物学多组学方法将有可能改变卒中管理并显著改善患者的预后。

评论

本文总结了目前利用多组学技术帮助开发脑卒中生物标志物的研究进展,全文从卒中的病理生理学方面阐明了卒中的发病机制、诊断及治疗预后等方面的问题,并为读者揭示了基因组学、转录组学、蛋白质组学和代谢组学等多组学技术在开发卒中生物标志物及治疗靶标方面的研究现状。这将为更多研究系统生物学方向的学者提供了很有价值的参考意见。

原始出处:

Alejandro Bustamante, et al.Multilevel omics for the discovery of biomarkers and therapeutic targets for stroke.Nature Reviews Neurology, https://doi.org/10.1038/s41582-020-0350-6

作者:胡龙龙    来源:微科享 

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