2024年第四届中国细胞与基因治疗大会 | 对话李大力教授：从实验室到临床，基因编辑技术最新进展与未来发展趋势

基因编辑技术是一种能够精确修改生物体DNA序列的先进生物技术，通过引入、删除或替换特定的DNA片段，来改变生物体的遗传特性。近年来，随着CRISPR-Cas9等高效基因编辑工具的发展，基因编辑技术在医学领域展现出了巨大的潜力和应用价值。基因编辑技术正在不断进步中，未来有望解决更多复杂的科学问题和社会挑战。然而，与此同时，也引发了关于伦理道德、安全性等方面的讨论，因此需要制定合理的监管政策和技术规范来指导其健康发展。

近期，第四届中国细胞与基因治疗大会在天津隆重举行，本次年会将汇聚国内外众多专家学者和业界精英，通过分享最新的科研成果、临床实践经验和技术创新，共同探讨细胞与基因治疗领域的热点问题和前沿趋势。在本次大会上，梅斯医学特邀来自华东师范大学李大力教授分享基因编辑技术的发展历程及其近年来在基因编辑领域取得重大成果。

梅斯医学：请您简单介绍下基因编辑技术的发展历程？

李大力教授：近年来，基因编辑技术备受瞩目，成为了科学界和公众关注的热点。随着技术不断进步，基因编辑正逐渐从实验室走向实际应用，为解决人类面临的许多难题提供了新的可能性。目前，科学界公认的基因编辑发展主要分为以下三代技术：

第一代技术：锌指核酸酶（ZFNs）

锌指核酸酶（ZFNs）的构建是通过将Cys2-His2锌指蛋白与FokI核酸内切酶的催化结构域相融合实现的。ZFN的DNA识别域通常由3到4个串联的锌指蛋白组成，每个锌指蛋白能够特异性地识别并结合一个三联体碱基序列。当这些锌指蛋白精确地定位到目标DNA序列上时，相连的FokI核酸内切酶就能在该位点产生双链断裂。

与传统的基因打靶技术相比，ZFNs显著提高了编辑效率。此外，通过向受精卵中直接注射ZFNs，可以快速生成具有特定基因修饰的小鼠模型，极大地缩短了实验周期。然而，ZFNs技术也存在一些明显的缺点：首先，设计和合成锌指蛋白的过程复杂且成本高昂；其次，整个操作流程需要大量的工作量和技术专长；最后，ZFNs在细胞内的表达可能会导致一定程度的细胞毒性，影响细胞健康和存活率。

尽管如此，ZFNs作为早期的基因编辑工具之一，在推动基因组工程的发展方面发挥了重要作用，并为后续更加高效、简便的技术如TALENs和CRISPR-Cas9奠定了基础。

第二代技术：转录激活因子样效应物核酸酶（TALENs）

第二代基因编辑技术，即转录激活因子样效应物核酸酶（TALENs），与锌指核酸酶（ZFNs）在原理上非常相似，都需要融合FokI核酸内切酶的催化结构域来实现对DNA的切割。然而，TALENs利用TAL效应模块来识别DNA序列中的单个碱基，这与ZFNs识别三个连续碱基的方式形成了鲜明对比。因此，TALENs提供了更高的灵活性和精确度，在设计和编辑DNA序列时具有更大的优势。

相较于ZFNs，TALENs不仅更容易获得且成本更低，还表现出较低的细胞毒性，这些特点使其自问世以来迅速获得了广泛的应用。尽管如此，TALENs仍存在一些局限性：首先，它们依然会对细胞产生一定的毒性；其次，构建TAL模块的过程相对复杂且耗时，尤其是在需要同时修饰多个基因或多位点的情况下，这种复杂性变得更加明显。这些因素限制了TALENs在某些高通量基因组编辑应用中的使用效率。尽管如此，TALENs依然是基因编辑领域中一项重要而有效的工具。

第三代技术：CRISPR-Cas系统

2020年诺贝尔化学奖授予了CRISPR-Cas9技术的开发者，以表彰这一革命性基因编辑工具对科学界的巨大贡献。CRISPR-Cas9通过设计特异性的向导RNA（gRNA）序列，并将其与Cas9核酸酶结合，精准定位到目标DNA位点进行切割。这项技术以其操作简便、成本低廉和高度可编程的特点，极大地提升了基因编辑的效率和准确性。

随着CRISPR-Cas系统的发展，研究人员进一步创新，开发出了碱基编辑器，这类工具能够在不依赖同源重组模板的情况下直接修改DNA上的单个碱基。例如，胞嘧啶碱基编辑器（CBEs）能够高效地实现从胞嘧啶（C）到胸腺嘧啶（T）或其他碱基的转换；而通过融合腺苷脱氨酶，则可以实现腺嘌呤（A）到鸟嘌呤（G）的直接替换。这些突破不仅扩展了CRISPR的应用范围，也为遗传疾病的治疗提供了新的途径。

我们实验室自始至终积极参与了基因编辑领域内的多项前沿研究。早在TALENs技术兴起时，我们就已开始探索其在精确基因修饰中的潜力。随后，在CRISPR-Cas9出现后，我们迅速跟进并深入研究了该系统的多方面应用，包括但不限于复杂结构的构建及多种遗传病模型的建立。我们的工作旨在推动基因编辑技术的进步，为未来的医学治疗和生物科学研究提供更加有效的工具。

梅斯医学：近年来在基因编辑领域取得哪些重要科学进展和技术突破？未来研究热点主要集中在哪些领域？

李大力教授：除了碱基编辑器（Base Editor, BE）之外，研究人员还开发了其他几种创新的基因编辑技术，以应对更复杂的遗传改造需求。由于BE仅能对单个碱基进行精确修改，对于需要操作更长、更复杂DNA片段的情况，以期能够实现更大范围的基因组改造，甚至包括大片段的整合。为此，研究人员在BE的基础上，通过融合逆转录酶并对gRNA进行改造，创建了先导编辑系统（Prime Editing, PE）。

先导编辑系统（Prime Editing, PE）利用一种特殊的gRNA——prime editing guide RNA (pegRNA)，该RNA不仅包含识别目标位点的信息，还携带了用于修复的人工设计序列。当pegRNA引导Cas9切口酶到达目标位置时，逆转录酶将pegRNA上的信息转录成DNA，并将其插入到断裂处。PE能够执行多种类型的基因编辑，包括任意12种碱基的替换、小片段碱基序列的定点插入或删除等。相比传统的碱基编辑技术，PE提供了更高的灵活性和多样性。然而，它在处理较大片段（通常几十个碱基对）以及在一些原代细胞或体内的体细胞中的效率仍有待提高。

为了解决更大片段DNA的整合问题，研究人员进一步探索了一种结合PE和位点特异性整合酶的方法。这种方法可以将特定的整合酶识别序列预先整合到基因组中，随后使用相应的整合酶将外源的大片段DNA准确地插入到预定位置。这项技术极大地扩展了基因编辑的应用范围，特别是在治疗因大范围基因缺陷导致的遗传病方面具有巨大潜力。

线粒体DNA突变引起的遗传疾病是人类健康的一大挑战。鉴于CRISPR-Cas9难以直接应用于线粒体DNA编辑（主要是因为gRNA难以进入线粒体），研究团队发现了一种名为DddA的双链脱氨酶。这种酶可以直接作用于双链DNA，而不需要先形成单链状态。通过与TadA（一种tRNA腺苷脱氨酶）融合，研究者们成功开发出能够在不切割DNA的情况下对线粒体DNA进行C到T转换的编辑工具。此外，韩国Paik实验室也基于类似策略实现了A到G的转换。

为了克服现有技术的局限性，尤其是针对不分裂细胞中的同源重组效率低下的问题，科学家们正在探索新的方法来实现大片段DNA的定点整合。例如，李伟教授领导的团队开发了一种基于R2逆转录转座子的系统，该系统可以通过RNA形式递送，随后在细胞内反转录为DNA并插入到基因组特定位置。这类新技术有望在未来成为强大的基因编辑工具，特别是在治疗那些由大片段缺失或重复导致的遗传性疾病方面展现出巨大的应用前景。因此，随着先进技术的发展和完善，基因编辑领域正朝着更加精准、高效的方向迈进，为解决复杂的遗传病提供前所未有的可能性。

梅斯医学：基因编辑技术在研究和应用中面临的伦理问题和安全性考量，如何建立健全的基因编辑技术伦理规范和监管机制？

李大力教授：从基因编辑从业者的角度来看，CRISPR-Cas9技术之所以获得诺贝尔奖，不仅在于其对生物学基础研究的贡献，更在于它在人类健康和基因治疗领域展现的巨大潜力。然而，随着技术的发展，也出现了一些争议性的事件，例如基因编辑婴儿案例，这些行为受到了广泛谴责，因为它们违反了伦理规范和科学共识。事实上，技术的进步往往快于相关伦理框架的建立。当一项新技术尚未成熟时，相应的伦理指导原则可能还未完善，这给监管带来了挑战。

为了应对基因编辑技术在研究和应用中面临的伦理问题和安全性考量，研究人员应具备高度的职业道德，明确了解并遵守科学研究中的界限。面对不确定的研究方向或潜在风险时，应当主动寻求同行专家、监管机构及伦理委员会的意见，确保所有研究活动都在法律和伦理许可的范围内进行。同时，伦理监管机构和技术专家需要对新兴技术保持高度警觉，提前预判可能出现的伦理问题，并据此制定预防措施。此外，除了科研人员和管理者之外，建立一个开放的信息交流渠道，让公众能够获取准确的信息，并表达他们对于新技术的看法和担忧，从而促进更加全面且包容的伦理框架建设。

总之，建立健全的基因编辑技术伦理规范和监管机制需要多方面的努力。这不仅包括研究者自身的严格自律，还包括伦理监管机构的高度敏感性和公众的积极参与。只有通过这样的方式，我们才能确保基因编辑技术在安全和伦理的前提下得到合理应用，从而更好地服务于人类健康和福祉。