118例中国大细胞肺癌的基因图谱，PI3K通路相关基因频繁突变且与预后较差相关

大细胞肺癌（LCLC）是一种侵袭性极强、预后极差的疾病。目前，对LCLC的分子病理学了解甚少。研究者采用癌症相关基因超深度测序和外显子组测序检测118对肿瘤-正常组织的LCLC基因突变，采用细胞功能检测来验证PI3K通路的潜在致癌突变。

突变模式由主导的A>C突变决定。显著非沉默突变频率（FDR）<0.05的基因包括TP53（47.5%）、EGFR（13.6%）和PTEN（12.1%）。此外，PI3K信号通路（包括EGFR、FGRG4、ITGA1、ITGA5和ITGA2B）是突变最多的通路，发生于61.9%（73/118）的LCLC样本。细胞功能检测证实PI3K通路的潜在致癌突变具有更恶性的细胞功能表型。多变量分析进一步显示，PI3K信号通路突变患者预后较差（P=0.007）。这些结果初步确定了LCLC中PI3K信号通路的频繁突变，并提示了治疗这种致命类型LCLC的潜在靶点。

研究背景

肺癌是全球癌症相关死亡的主要原因，主要分为小细胞肺癌（SCLC，10-15%）和非小细胞肺癌（NSCLC，80-85%）。NSCLC主要由腺癌、鳞状细胞癌、大细胞神经内分泌癌（LCNEC）和大细胞肺癌（LCLC）组成。世界卫生组织（WHO）将LCNEC归类为神经内分泌癌，而其管理和临床表型常被认为与小细胞肺癌（SCLC）一致。LCLC是一种罕见的肿瘤，发病率为2.5/10万人。2021年WHO肺肿瘤新分类将LCLC定义为未分化NSCLC，在细胞学、组织学结构和免疫表型方面缺乏小细胞癌、腺癌、鳞状细胞癌和神经内分泌癌的特征。经辅助免疫组织化学（IHC）分析，手术切除的未分化NSCLC病例，肺细胞标志物甲状腺转录因子-1（TTF-1）或鳞状细胞标志物p40表达阴性的，被归类为LCLC。

LCLC患者通常不表现出早期症状，这可能导致较晚的诊断和较差的治疗。虽然LCLC倾向于广泛传播，但其发病机制尚不清楚。此外，对于LCLC的理想治疗方法和潜在的治疗分子靶点知之甚少。到目前为止，对LCLC潜在基因的研究大多集中在少数基因上。最近对9个LCLC肿瘤的外显子组序列进行了研究，结果显示TP53基因频繁变异。LCLC的体细胞突变范围仍不完全清楚。因此，深入研究LCLC的病因和进展对提高肺癌的生存率至关重要。

研究方法

2009-2015年，118例未接受放化疗的中国LCLC患者纳入本研究。其中22例被招募进行全外显子组测序，90例被招募进行靶向深度测序，6例被招募进行这两项。组织病理学分析证实所有LCLC诊断，在附近的对照样本中未发现肿瘤细胞。肿瘤组织及其匹配的正常组织的DNA样本进行靶向测序和外显子组测序。

研究结果

研究者对28对LCLC组织和匹配病例的正常组织的整个外显子组进行了测序，以分析LCLC的体细胞突变谱。研究者发现了1397个体细胞插入或缺失（indels）和11065个体细胞单核苷酸变异（SNVs），根据严格标准（由SnpEff7中的高或中等效应来定义），这些变异有望改变蛋白质编码序列。总体而言，每Mb发现1.96个突变。

核苷酸突变模式可能揭示肿瘤细胞中发生的特定突变过程。本研究最常见的一种替换是C>T/G>A变异，占LCLC中检测到的所有体细胞 SNVs的30.6%（3382/11065）（图1）。此外，在TCN位点的C>T突变，特别是在TCA位点，主导了三核苷酸特征（图1）。APOBEC3B的理想基序是TCA。此外，膀胱、乳腺、头颈部和肺部的恶性肿瘤也存在APOBEC突变模式。APOBEC突变存在于LCLC中，提示APOBEC胞苷脱氨酶突变在LCLC发病机制中起重要作用。

图1

MutSigCV10确定了36个基因（包括TP53、AHNAK2、MUC5B、PDE4DIP和MAP3K21）有统计学显著的频繁非同义体细胞突变（图2）。采用MuSiC路径扫描（P<0.05），研究还发现体细胞突变集中在PI3K-Akt通路、ECM-受体相互作用、昼夜节律夹带和与癌细胞信号转导相关的R逆行内源性大麻素信号通路中。

图2

在几乎所有类型的癌症中，频繁突变的基因仅限于少数癌症相关基因。研究者创建了包含104个候选基因的癌症基因panel，这些候选基因在外显子组测序中经常发生突变（包括TP53、ITGA1、PTEN、ITGA2B、STK11和EGFR），或者通常与多种癌症相关（包括TP53、ITGA1、PTEN、ITGA2B、STK11和EGFR）。利用超深度靶向测序在96对LCLC-正常组织中对这些基因进行了测序，其中6对还通过全外显子组测序进行了检测。

总共发现了1232个非沉默SNVs，因此总突变率为3.29/Mb。大约61.9%（73/118）的LCLC肿瘤组织存在PI3K信号通路基因的显著变异（FDR<0.05；图3）。

图3

TP53、EGFR、PTEN、STK11和FGFR4基因的突变率分别为47.5%、13.6%、12.1%和11.1%（图3）。其中，TP53突变是一种常见的基因变异，被认为存在于超过50%的人类癌症中，包括LCLC（图3）。PTEN和STK11肿瘤抑制基因失活突变已经在肺癌病因学中进行了研究，并被发现有利于癌症的发展。与此类似，研究者发现了STK11的7种突变（编码p.Lys41X、p.Gly56Arg、p.Glu130X、p.Met136Leu、p.Asp194Glu和p.Phe354Leu）和PTEN的6种突变（编码p.Gly4Arg、p.Cys65Ser、p.His122Asp、p.Arg130X）。

值得注意的是，PI3K信号通路有显著的体细胞突变（图3）。结合来自118份样本的靶向测序和全外显子组测序的数据后，研究者发现61.9%（73/118）的LCLC在PI3K信号通路中有改变蛋白质序列的突变。研究者在LCLC的25个PI3K通路相关基因（TP53、EGFR、PTEN、STK11、FGFR4、COL4A1、ITGA5、TNN、HGF、SGK2、COL4A2、THBS4、IFNA10、IL3、ITGA2B、RPS6KB2、ITGA1、PHLPP2、TCL1A、GNG10、PIK3CA、GNG8、EIF4B、AKT2和PDK1）中发现了47个非沉默体细胞突变（图4a、b）。虽然通路中的某些变异并不互斥，但大多数变异是互斥的，尤其是STK11、FGFR4和COL4A1的变异。

图4

PI3K通路突变与LCLC患者评估的任何个体临床病理特征之间均无显著相关性，如年龄、性别、组织病理亚型、TNM分期、淋巴结转移、血管侵犯、肺膜侵犯、切缘状态、最大径和吸烟（P>0.05）。

采用Cox回归模型进行单变量分析，以评估临床因素是否影响LCLC预后，如年龄、性别、组织病理亚型、TNM分期、淋巴结转移、血管侵犯、肺膜侵犯、切缘状态、最大直径、吸烟、PI3K通路突变状态等（表1和图3c）。在LCLC患者中，TNM分期、肿瘤直径和PI3K通路突变状态与较短的OS持续时间显著相关（P<0.05；表1）。此外，当采用log-rank检验比较Kaplan-Meier生存曲线时，研究者发现PI3K通路突变与LCLC患者较短的OS持续时间显著相关（P=0.007；图3c）。此外，采用Cox回归模型进行的多变量分析表明（表2），PI3K通路突变与不良预后强相关[风险比（HR）=6.681；可信区间（CI）：2.253-9.669；P=0.001]。

表1

表2

为了确定PI3K通路突变的致癌性，研究者首先使用RNA干扰来导致功能缺失以验证NCI-H460中PI3K家族成员的致癌性倾向。研究结果表明，TP53、PTEN和STK11的时间依赖性沉默阻碍了NCI-H460细胞的发育。值得注意的是，NCI-H460细胞的时间依赖性生长抑制（图4a）是由EGFR、FGFR4、ITGA1和ITGA2B的沉默引起的。

接下来，研究者在LCLC细胞系NCI-H460和HEK293T细胞系中过表达EGFR（p.Ser177Leu、p.Arg254Lys、p.Asn261Asp、p.Leu591Arg、p.Glu631Lys和p.Ser660Thr）、FGFR4（p.Arg154His、p.Thr179Ala、p.Ile197Thr、p.Ala346Thr和p.Ser384Phe）、ITGA1（p.Thr480Met）和ITGA2B（p.Gly462Arg）的突变体（图4b）。在过表达EGFR、FGFR4、ITGA1或ITGA2B突变体后，与模拟组相比，NCI-H460和HEK293T细胞系增殖明显增加（P<0.05；图4c）。此外，与野生型EGFR、FGFR4、ITGA1或ITGA2B的转染相比，EGFR（p.Arg254Lys、p.Asn261Asp和p.Leu591Arg）、FGFR4（p.Arg154His、p.Ile197Thr和p.Ala346Thr）、ITGA1（p.Thr480Met）或ITGA2B（p.Gly462Arg）的突变体诱导HEK293T或NCI-H460细胞系的细胞生长极其显著的增加（P<0.001；图4c）。这些数据表明，PI3K基因突变具有致癌潜能，这些激活性PI3K通路基因变异的存在提示，PI3K通路与LCLC的发生和进展有关。

讨 论

目前对于LCLC的体细胞突变、理想治疗方法以及潜在的治疗分子靶点知之甚少。据报道，EGFR突变是NSCLC中最常见的驱动突变。大多数EGFR敏感突变的NSCLC患者在接受EGFR酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-TKI）治疗后会出现耐药突变。

在公开验证的NCSLC队列中，FGFR4变异与较高的ORR、较长的中位总生存期和PFS相关。FGFR4变异被证实为患者较好的PFS和OS的独立预测因素。此外，FGFR4变异与较高的TMB水平、肿瘤间质中较多的CD8 T细胞以及肿瘤中心和间质中较高的肿瘤相关巨噬细胞M1/M2比值相关，提示FGFR4变异可能是NSCLC免疫检查点抑制剂疗效的潜在独立预测因素。

最近的研究表明，ITGA亚家族的基因在多种肿瘤中发挥着重要作用。然而，关于不同ITGA蛋白和突变在NSCLC中的表达和作用知之甚少。ITGA家族在NSCLC中突变率较高（44%）。基因本体功能富集分析结果显示，差异表达的ITGAs可能参与了与细胞外基质（ECM）组织、含胶原的ECM细胞成分和ECM结构组成分子功能相关的功能。ITGAs的表达与NSCLC多种免疫细胞的浸润显著相关。ITGAs可能在调节肿瘤进展和免疫细胞浸润中发挥重要作用，可作为NSCLC潜在的预后生物标志物。

总之，本研究揭示了LCLC中A>C/T>G转换的高发生率，识别了LCLC的驱动基因，并阐明了一个中心PI3K信号网络，首次系统地建立了LCLC的体细胞突变框架。重要的是要记住，当存在PI3K通路基因变异时，LCLC患者的预后不良。这些发现提示，有PI3K通路突变的患者可能从现有或未来的靶向药物中获益。

参考文献：

Guo, Jun-Hong et al. “Whole-exome and targeted gene sequencing of large-cell lung carcinoma reveals recurrent mutations in the PI3K pathway.” British journal of cancer vol. 129,2 (2023): 366-373. doi:10.1038/s41416-023-02301-2