揭秘益气通络颗粒如何攻克缺血性脑卒中：网络药理学与多组学的神奇联手！

脑梗死，亦被称为缺血性中风，每年导致约550万人不幸离世，并给全球经济带来沉重负担。缺血性中风约占所有中风病例的85%，其病理机制在于中枢神经系统局部发生的病变，导致血管阻塞，进而引发急性神经损伤，使大脑血液供应不足。在这一过程中，脑组织的神经元受到能量或离子泵功能异常的干扰。目前，临床治疗的主要策略在于恢复血液流动，但据文献报道，修复过程可能会引发再灌注损伤。

经科学验证，传统中药（TCMs）对于由胰岛素抵抗（IR）引发的多器官功能紊乱及损伤，具有卓越的预防与治疗效果，并且在缺血性卒中患者的治疗中已得到实际应用。益气通络颗粒（YQTL）是基于古老的补阳还五汤配方进行优化改良的制剂，其原始配方注重益气活血，临床应用历史悠久。

YQTL中黄芪甲苷IV作为黄芪的活性成分，对缺血性脑损伤、炎症抑制、氧化应激和细胞凋亡等具有关键作用。丹参则通过其活性成分，如丹参酮IIA等，能调节TLR4和NF-κB通路，从而减少缺血性脑损伤导致的炎症损害。此外，其他成分亦具备激活血液循环的功效。

此前，一篇名为“Elucidation of the mechanism of Yiqi Tongluo Granule against cerebral ischemia/reperfusion injury based on a combined strategy of network pharmacology, multi-omics and molecular biology”的论文阐明了YQTL预防脑缺血/再灌注损伤（cerebral ischemia/reperfusion injury，CIRI）的机制。

图1 论文首页

YQTL减少CIRI

YOTL在不同剂量下均表现出对I/R损伤的抵抗作用（图2A-B）。低剂量时，其抗损伤效果相对较弱；而中剂量与高剂量之间的疗效差异并不显著。由此，研究确定了YQTL的最佳治疗剂量为5.4g/kg，并在此剂量下进行了后续的实验研究。

为评估小鼠的神经损伤程度，研究采用了Bederson评分进行量化分析。YQTL明显减轻了I/R诱导的神经损伤，其评分在再灌注12、24、48小时后均低于模型组（图2C）。此外，研究在MCAO/R后的12、24和48小时进行了TTC染色，以评估CIRI梗死灶的大小。结果表明，假手术组未见脑梗死，而模型组在再灌注后均出现严重的脑梗死，其中24小时和48小时组的梗死区域超过了脑容量的40%。然而，与模型组相比，YQTL组的梗死体积百分比显著降低（图2D-E）。

为了检测神经元的存活状态，研究还进行了抗NeuN染色，该染色能够特异性地与神经元核结合，其染色强度可以反映神经元的功能状态。结果显示，模型组小鼠出现了神经元死亡的现象；而YQTL组的NeuN免疫反应性显著增加，表明YQTL能够抑制神经元死亡（图2F）。

图2 YQTL对CIRI的保护作用

网络药理学分析了YQTL对CIRI的作用机制

研究通过进一步分析确定了705个与CIRI相关的靶标，构建PPI网络，精准识别了候选靶标（图3）。经过数据整合，合并后的网络包含83个关键节点，从而预测了YQTL抗CIRI的潜在靶标（图3C）。

在此基础上，研究还运用GO和KEGG通路分析深入揭示了这些靶标的预测作用机制。与CIRI密切相关的前10个GO条目已明确列出，其中细胞凋亡和细胞增殖的正调控在GO条目中呈现出显著富集，为抗CIRI作用机制提供了重要线索（图3D）。

进一步分析发现，存在多个显著富集（FDR<0.05）的代谢途径，包括Rap1、cAMP、MAPK、VEGF和PI3K-Akt信号通路等。这些通路在抗CIRI过程中可能发挥着关键作用。图3E展示了前20个显著富集的代谢途径，这些结果不仅证实了网络药理学分析的有效性，而且为后续深入研究药物抗CIRI机制提供了重要依据。

图3 YQTL针对CIRI的候选靶点的鉴定、GO和KEGG富集分析

转录组学鉴定了与YQTL对CIRI的作用相关的基因和通路

经过对假手术组、模型组和YQTL组之间的基因表达进行比较分析，发现存在显著差异（图4）。具体而言，假手术组和模型组之间共有2322个基因表达存在显著差异，其中590个基因表达上调，1732个基因表达下调。而在模型组和YQTL组之间，共检测到2234个差异表达基因，其中714个基因表达上调，1520个基因表达下调。

为了深入了解这些差异表达基因的功能和调控机制，研究进一步对这2234个基因进行了GO和KEGG通路分析。结果表明，共有443个GO项显著富集（FDR< 0.001），其中前10项如图4C所示，主要涉及炎症反应、免疫系统过程和血管生成的正调节过程等生物过程。此外，研究者还筛选出了17个与CIRI密切相关的通路（4D），这些通路可能在假手术组、模型组和YQTL组之间的差异表达中起到重要作用。

图4 YQTL对CIRI的作用机制的转录组学鉴定

YQTL调控与该潜在途径相关的蛋白的表达

为深入探究YQTL是否对PI3K-Akt、MAPK/ Erk以及cAMP信号通路具有调控作用，研究者对脑组织中相关蛋白的表达进行了检测。如图5所示，IR明显抑制了PI3K和AKT的磷酸化水平，同时促进了MEK1/2和Erk1/2的磷酸化，并进一步推动了Epac的降解。然而，这些由IR引发的负面效应在很大程度上被YQTL所抵消。值得注意的是，YQTL对PKA蛋白的表达并未产生显著影响。因此，YQTL有效激活了被CIRI抑制的PI3KAkt和cAMP-Epac信号通路，并抑制了CIRI所激活的MAPK/Erk信号通路。

图5 CIRI后YQTL对PI3K-AKT信号通路、MAPK/Erk信号通路和cAMP信号通路的影响

YQTL调控与潜在通路或细胞凋亡相关的基因的表达

研究运用qPCR技术对编码相关通路及凋亡蛋白的mRNA水平进行了精确测定。在CIRI后，PI3K、AKT、Epac的mRNA转录水平出现下调，而MEK1/2、Erk1/2、caspase-3的mRNA转录水平则呈现上调趋势（图6）。与模型组相比，YQTL对PI3K、AKT和Epac的表达产生了显著的上调作用，并相应地下调了MEK1/2、Erk1/2和caspase-3的表达。值得注意的是，YQTL对PKA的表达并未产生显著影响。此外，模型组的Bcl-xl/Bax比值出现降低，而YQTL则使其显著升高。YQTL还通过下调caspase-3的表达进一步增加了Bcl-xl/Bax比值，这提示YQTL可能具有抑制CIRI诱导的细胞凋亡的作用，且mRNA的表达结果与蛋白质的表达结果呈现出一致性。

图6  采用定量RT-PCR方法检测其mRNA的表达量

结论

综上所述，YQTL能够通过调节PI3K-Akt、MAPK和cAMP等关键信号通路，对CIRI产生显著的保护作用。这一发现为我们深入理解和应用YQTL的保护机制提供了新的视角和思路。

参考文献：

Yuan Y, Sheng P, Ma B, Xue B, Shen M, Zhang L, Li D, Hou J, Ren J, Liu J, Yan BC, Jiang Y. Elucidation of the mechanism of Yiqi Tongluo Granule against cerebral ischemia/reperfusion injury based on a combined strategy of network pharmacology, multi-omics and molecular biology. Phytomedicine. 2023 Sep;118:154934. doi: 10.1016/j.phymed.2023.154934