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张峰团队这次慢了一步丨第三种可以编辑人类细胞基因组的CRISPR-Cas系统

Tags: 基因编辑  技术  更新:2019-1-23
CRISPR-Cas系统为细菌和古菌抵抗外界病毒入侵的适应性免疫,基于此已开发出了两套基因编辑系统: CRISPR-Cas9和CRISPR-Cas12a(Cpf1)。它们能有效地编辑动植物的基因组,极大地推动了基因编辑相关领域的发展。但Cas9系统存在脱靶效应、Cas9和Cas12a蛋白的尺寸太大,是否能找到尺寸更小、特异性更高的效应蛋白对整个基因编辑领域意义重大,尤其是治疗性基因编辑方面的应用。

北京时间1月23日,来自MIT的张峰团队在Nature communication上发表了题为Engineering of CRISPR-Cas12b for human genome的研究论文,开发了第三种基因编辑工具CRISPR-Cas12b,该工具经过改造后也能在哺乳动物和人体中进行有效的基因编辑。

早先报道核酸酶 (AacCas12b)保持体外切割活性的温度范围是40℃至55℃,这不适合于哺乳动物基因组编辑。研究人员用BLAST找出了27个V–B型的Cas12b蛋白,排除了来源于嗜热菌和先前研究过的还剩14个候选者,最终发现四个Cas12b (AkCas12b、BhCas12b、EbCas12b、LsCas12b)可能有活性。体外实验表明,AkCas12b和BhCas12b在37℃仍具有较强的DNA切割活性,把tracrRNA和crRNA融合成一个sgRNA后也能保持切割活性。

有意思的是,这两个核酸酶在细胞系也能检测到切割活性,虽然插入缺失突变的比例不到1%。为了提高在细胞内的切割效率,研究人员首先优化了相应的sgRNA序列,发现BhCas12b的切割活性提高了30倍。研究人员进一步发现AkCas12b和BhCas12b倾向于在DNA非靶向链上产生缺口,提示可能是由于Cas12b结构比较紧凑,影响了靶向链进入RuvC活性中心。AacCas12b与DNA复合物的晶体结构揭示了RuvC活性中心与DNA底物互作的关键氨基酸。为了提高BhCas12b与DNA的亲和力和切割活性,作者测试了176个突变体,发现K846R 和S893R能显着提高切割活性。

适冷酶表面富含甘氨酸,这增加了蛋白的柔性和酶活。为了进一步提高BhCas12b的酶活,研究人员测试了66个BhCas12b表面的氨基酸替换成甘氨酸突变体的酶活,发现突变体E837G(位于gRNA:DNA 双链和RuvC活性中心之间)能至少提高两倍的酶活。

综上,研究人员构建了酶活最高的突变体BhCas12b v4(K846R/S893R/E837G),它有以下几个优点:(1)酶活与SpCas9、AsCas12a相当,但特异性比更SpCas9更高,其安全性更适合于临床应用;(2)在基因组里PAM数量与AsCas12a相当,扩大了基因组的靶向范围;(3)蛋白更小(BhCas12b:1108个氨基酸、SpCas9:1369个氨基酸、AsCas12a:1353个氨基酸),尤其适合用于腺相关病毒AAV介导的基因治疗。因此,该系统具有极大的应用前景,有望开发出新一代安全高效的基因编辑工具。

特别值得一提的是,不久前(2018年11月27日)来自中科院动物所李伟课题组在Cell Discovery杂志上发表了题为Repurposing CRISPR-Cas12b for mammalian genome engineering的相似研究成果,同样鉴定出了一个名为Cas12b(又称为C2c1)的新CRISPR系统,能够编辑人类细胞基因组并应用于制备动物疾病模型。据悉,针对这项新技术,该研究团队已于一年前提交了专利申请,并正在开发这项技术在基因治疗中的应用。
作者:佚名   来源:BioArt  

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