江南大学AM：基于双组氨酸的细胞印迹水凝胶，实现循环肝癌细胞的精确捕获与动态释放！

循环肿瘤细胞（CTCs）的检测在诊断肝癌方面具有显著优势，因为它具有非侵入性、实时监测和动态追踪的特点。然而，基于CTCs的诊断在临床应用中主要受到在复杂血液环境中捕获低丰度CTCs的挑战，同时还要确保这些细胞存活。在这里，江南大学陈敬华&大连医科大学附属第二医院王琪&中国科学院大学卿光焱设计了一种超强配体，L-组氨酸-L-组氨酸（HH），特别针对CTCs表面的唾液酸化糖链。进一步地，HH被整合到一个细胞印迹聚合物中，构建了一个具有精确CTCs印迹、高弹性、令人满意的血液相容性和强大的抗干扰能力的水凝胶。这些特性赋予了水凝胶在周围血液中捕获CTCs的卓越效率（>95%），以及可控地释放活体CTCs的能力。临床测试证实了使用这种方法可以准确区分肝癌、肝硬化和健康组。显著的诊断准确性（94%）、无损释放CTCs、材料可逆性以及成本效益（每样本6.68美元）使基于HH的水凝胶成为肝癌诊断和单细胞分析的潜在革命性技术。该研究以题为“Precise Capture and Dynamic Release of Circulating Liver Cancer Cells with Dual-histidine-based Cell Imprinted Hydrogels”的论文发表在《Advanced Materials》上。

图1展示了基于双组氨酸（HH）的细胞印迹水凝胶用于捕获和释放肝循环肿瘤细胞（CTCs）的设计概念。该设计利用了肝癌CTCs表面丰富的唾液酸化糖链（SGs）作为结合靶标，并特别设计了HH配体通过多重氢键与其作用。通过将HH整合到细胞印迹聚合物中，构建了一种具有精确CTCs印迹、高弹性、良好的血液相容性和强大的抗干扰能力的水凝胶。这种水凝胶在捕获外周血中的CTCs方面展现出了卓越的效率（>95%），并且能够可控地活体释放CTCs。

图1. 用于捕获和释放肝循环肿瘤细胞（CTCs）的细胞印迹水凝胶的设计概念

【HH对Neu5Ac或SG的亲和力评估】

图2详细评估了设计的双组氨酸（HH）配体对N-乙酰神经氨酸（Neu5Ac）和唾液酸化糖链（SGs）的亲和力。通过等温滴定量热法（ITC）实验，HH与Neu5Ac的结合常数（KD）被确定为5.41×10^-6 M，表明了两者之间的强相互作用。此外，HH与典型的SG片段（Neu5Ac-α(2−6)Gal-β(1−4)Glc）的结合导致了显著的热量吸收，其KD值为8.15×10^-7 M，显示了更强的结合能力。量子化学计算进一步支持了HH与Neu5Ac之间通过氢键形成的稳定复合物。此外，通过共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）和流式细胞仪实验验证了HH对SMMC-7721细胞表面唾液酸化糖链的高选择性结合。最后，通过基于HH@SiO₂的微型固相萃取（SPE）柱策略，成功从胎蛋白的胰蛋白酶消化产物中富集了唾液酸化糖肽（GPs），并通过质谱（MS）分析确认了富集效果，展示了HH作为捕获单元对SGs的潜力。这些结果为PP-co-AHH+水凝胶的高效率CTCs捕获能力提供了分子层面的解释。

图2. HH对Neu5Ac或SG的亲和力评估

【PP（聚（聚乙二醇二甲基丙烯酸酯））水凝胶框架的性能】

图3展示了不同水凝胶材料的物理性能和作为CTCs捕获材料的适用性。研究者比较了聚丙烯酰胺（PAAm）、聚乙烯醇（PAA）和聚（聚乙二醇二甲基丙烯酸酯）（PP）水凝胶在磷酸盐缓冲液（PBS）中的膨胀比率和形态变化。结果显示，PAAm和PAA水凝胶在PBS中88小时后出现了显著的膨胀，而PP水凝胶则表现出较低的膨胀比率，这使得PP水凝胶成为更适合作为CTCs捕获材料的框架。此外，通过低场核磁共振（LF-NMR）分析确认了PP水凝胶的低膨胀性质，并通过扫描电子显微镜（SEM）和能量色散谱（EDS）分析了PP-co-AHH水凝胶的微观形态和元素分布。SEM图像显示PP-co-AHH水凝胶由众多聚合物纤维组成，表面均匀，且通过应力松弛实验验证了其良好的压缩回复性能。

图3.PP（聚（聚乙二醇二甲基丙烯酸酯））水凝胶框架的性能

【水凝胶的生物相容性评估】

图4评估了不同水凝胶材料的血液相容性，包括溶血比率、血液凝固时间、蛋白质吸附量以及与人类红细胞（RBCs）、白细胞（WBCs）和SMMC-7721细胞的细胞相容性。实验结果表明，PAA-co-MBA、PAAm-co-MBA、PP和PP-co-AHH水凝胶均展现出低于5%的溶血比率，证明其非溶血性质。在血液凝固时间测试中，PP-co-AHH水凝胶的凝血时间最接近空白对照组，表明其对血液凝固的影响最小。蛋白质吸附实验显示，基于PP的水凝胶（PP和PP-co-AHH）表现出较低的蛋白质吸附量，揭示了它们良好的抗污染特性。细胞相容性测试中，PP和PP-co-AHH水凝胶在孵育4小时后，细胞活性保持在90%以上，而PAA-co-MBA和PAAm-co-MBA水凝胶的细胞活性较低，这可能归因于MBA单元的细胞不兼容性。SEM观察到SMMC-7721细胞在PP-co-AHH水凝胶表面良好粘附并分裂，而血液样本中的RBCs和WBCs在水凝胶表面的粘附数量很少。这些发现证实了PP-co-AHH水凝胶具有优异的血液和细胞相容性，以及低蛋白质吸附能力，使其成为一个理想的生物医学材料平台。

图4. 水凝胶的生物相容性评估

【用细胞印迹法制备的PP-co-AHH+水凝胶的制备和功能评估】

通过使用SMMC-7721细胞作为模板，研究者制备了具有特定微界面的PP-co-AHH+水凝胶，这些微界面能够精确匹配细胞的形态。实验结果表明，该水凝胶能够有效地捕获SMMC-7721细胞，捕获效率随孵育时间增加而提高，并在三小时后达到最大。此外，即使在细胞浓度极低的情况下，PP-co-AHH+水凝胶仍能保持高捕获效率，证明了其对CTCs的高特异性和亲和力。更重要的是，被捕获的细胞能够通过温和的胰蛋白酶-EDTA溶液处理而释放，并且释放后的细胞保持了高度活性，能够进行正常的增殖和传代。此外，PP-co-AHH+水凝胶在复杂的血液环境中也能有效地捕获SMMC-7721细胞，且能够在多次捕获-释放循环后保持高效性。

图5.用细胞印迹法制备的PP-co-AHH+水凝胶的制备和功能评估

【通过AFP、CTCs和NK细胞进行肝癌临床评估】

图6展示了通过AFP（甲胎蛋白）、CTCs（循环肿瘤细胞）和NK细胞（自然杀伤细胞）进行肝癌临床评估的结果。首先使用AFP作为肝癌的生物标志物进行检测，发现其在低AFP值（小于20 ng/mL）的肝癌患者中敏感性和特异性有限，导致需要新的指标来提高诊断的准确性。通过PP-co-AHH+水凝胶捕获CTCs，并结合免疫细胞化学分析，研究者能够在肝癌患者的血液中成功区分CTCs，并且CTCs的检测在诊断肝癌时显示出比AFP更高的敏感性和特异性。此外，NK细胞的分析表明，它们在肝癌患者中的比例与AFP和CTCs相比具有不同的优势，尤其是在区分肝癌和非肝癌个体时。通过机器学习（ML）模型的分析，结合AFP、CTCs和NK细胞的多指标检测，进一步提高了肝癌诊断的准确性。研究者还对PP-co-AHH+水凝胶的成本效益进行了评估，证明了其在肝癌诊断中的潜在应用价值，尤其是在资源有限的地区。这些结果表明，结合AFP、CTCs和NK细胞的多指标检测方法，可以显著提高肝癌的早期诊断准确性，尤其是在AFP检测不敏感的情况下。

图6. 通过AFP（甲胎蛋白）、CTCs（循环肿瘤细胞）和NK细胞（自然杀伤细胞）进行肝癌临床评估

【通过多指标组合提高诊断准确性】

图7使用了机器学习（ML）模型来分析不同指标组合对肝癌诊断的影响。结果显示，结合AFP（甲胎蛋白）、CTCs（循环肿瘤细胞）和NK细胞的指标不仅提高了肝癌与非肝癌个体的区分度，而且在机器学习模型中表现出最高的诊断准确率和接受者操作特征曲线下面积（AUC）值。特别是，AFP+CTCs+NK的组合在KNN（K最近邻）模型中实现了0.996的AUC值和0.938的F1分数，表明这种多指标组合能显著提高肝癌诊断的准确性。此外，研究者还对PP-co-AHH+水凝胶进行了捕获-释放循环实验，证明该材料在经过10个循环后仍保持高效的CTCs捕获和释放能力。这些发现证实了PP-co-AHH+水凝胶作为一种成本效益高、可重复使用且高效的CTCs富集材料，在肝癌诊断中具有重要的应用潜力。

图7. 通过多指标组合提高诊断准确性

【基于糖蛋白质组学分析的结合机制研究】

图8通过糖蛋白质组学分析探究了PP-co-AHH+水凝胶与循环肿瘤细胞（CTCs）的结合机制。首先从SMMC-7721细胞膜提取膜蛋白，并通过酶解、脱盐和富集等步骤，利用HH@SiO₂材料捕获糖肽（GPs）。通过液相色谱-质谱（LC-MS）鉴定，成功识别出349个GPs和200个非修饰肽，其中唾液酸化糖肽（SGPs）占大多数，表明HH@SiO₂对SGs具有高亲和力。进一步的实验显示，经唾液酸酶或PNGase F处理的SMMC-7721细胞，其被PP-co-AHH+水凝胶捕获的效率显著下降，证实了SGs在材料结合中的重要性。通过基因表达和细胞功能实验，发现MEGF8和PPP2R2C两个SGPs在肝癌CTCs中表达上调，并可能作为水凝胶捕获CTCs的关键结合位点。这些发现为PP-co-AHH+水凝胶的分子识别机制提供了深入的理解，并揭示了通过SGs实现CTCs捕获的潜在分子靶标。

图8. 基于糖蛋白质组学分析的结合机制研究

【小结】

该研究通过特异性靶向循环肿瘤细胞（CTCs）表面的唾液酸化糖肽，设计了一种超强亲和力配体His-His，并将其整合到基于PEGDMA的细胞印迹共聚物中。这种材料因其精确的尺寸匹配、特异性相互作用和令人满意的生物相容性，展现出了卓越的CTCs捕获能力和完整的细胞释放特性，从而显著促进了肝癌的早期诊断和单细胞多蛋白质组学分析。此外，该技术在AFP（甲胎蛋白）低敏感性区域（小于20 ng/mL）内具有出色的性能，这是一个具有重要临床意义的挑战性诊断范围。研究者正在进行涉及1000个样本的更大规模临床测试，以验证该技术在早期肝癌诊断中的显著优势，并预计将对肝癌诊断领域产生深远影响。

原文链接：

https://doi.org/10.1002/adma.202402379