成功率高！研究肺癌中使用直径1.1mm冷冻探针获取组织标本行DNA、RNA-based NGS

目前，综合使用二代测序（NGS）进行分子筛选用于非小细胞肺癌（NSCLC）的病理评估被认为是临床实践的标准。对于使用直径1.1 mm冷冻探针取样的肿瘤组织进行NGS的可行性，我们知之甚少。本研究旨在探讨使用直径1.1 mm冷冻探针的经支气管冷冻活检（TBC）获得的标本用于NGS分析的适用性。本研究纳入2020年10月至2023年4月使用直径1.1 mm冷冻探针的TBC获得的标本进行NGS检测的肺癌患者。采用直径4.0或3.0 mm的支气管镜，径向探头支气管内超声和虚拟支气管镜导航探测肺外周病变。所有手术均在X线透视指导下完成。对数据进行回顾性分析。本研究的主要终点是NGS的诊断率，定义为成功测序事件数除以受试者总数。组织表面积用每个样本的最长径乘以垂直径计算，采用配对t检验进行比较。

研究期间共56例患者使用1.1 mm冷冻探针行TBC进行NGS检测。大多数患者（98%）处于晚期肺癌（复发或不可手术的III期或IV期肺癌）。基于DNA和RNA的NGS测序的诊断率均为95%（53/56）。中度出血3例（5%），无一例发生气胸或肺部感染等危及生命的并发症。对于DNA和RNA测序，1.1 mm直径的冷冻探针是一种有用和安全的NGS分析工具。

研究背景

大多数诊断为NSCLC的患者表现为晚期疾病和不良预后。然而，近几十年来，以靶向治疗为核心的精准医学显著改善了晚期NSCLC患者的生存结局。几份指南强烈建议对EGFR、ALK、KRAS、ROS1、BRAF、NTRK1/2/3、MET外显子14跳跃、RET和ERBB2（HER2）突变进行分子检测，并通过广泛的分子谱分析确定可能已经有有效药物的罕见驱动突变。因此，综合使用二代测序（NGS）进行分子筛选用于非小细胞肺癌（NSCLC）的病理评估现在被认为是临床实践的标准。此外，考虑到融合的高频率，设计捕获此类融合的基于RNA的NGS或基于DNA的NGS是推荐的分析选择。

大多数驱动突变见于腺癌，而腺癌通常位于肺实质周边。从肺外周腺癌中获取大量组织一直是呼吸科医师面临的挑战。此外，使用凸探头支气管内超声（EBUS）进行穿刺活检只能获得有限体积的肿瘤组织。因此，需要一种以微创方式采集尽可能多的肿瘤组织的活检模式，尤其是对于晚期NSCLC患者。

在各种支气管镜技术中，经支气管冷冻活检（TBC）被认为是提高径向探头EBUS诊断率的重要方法。最近的一项研究表明，使用直径为1.9 mm的冷冻探针进行TBC有助于获得足够的样本用于全外显子组测序。然而，大家担心直径为1.9 mm或1.7 mm的厚冷冻探针的灵活性，当需要支气管镜的大弯曲角度时，通常很难引入这种探针。为了克服这一限制，可使用直径1.1 mm的冷冻探针进行采样。然而，关于使用直径1.1 mm冷冻探针取样的肿瘤组织进行NGS的可行性，我们知之甚少。在这项研究中，研究者研究了使用直径1.1 mm冷冻探针的TBC获得的样本进行NGS分析的适用性。

研究结果

患者特征：

共56例患者在研究期间使用1.1 mm冷冻探针进行了TBC。表1总结了患者的临床特征。中位年龄69岁（范围：39-84岁），男性35例（63%）。大多数患者（98%）处于晚期肺癌（复发或不可手术的III期或IV期疾病）。初治和既往接受过治疗的患者数量分别为49例（88%）和7例（13%）。

表1

支气管镜检查的结果和安全性：

所有参与者均无恶性支气管内病变。使用1.1 mm冷冻探针的TBCs的中位数为2（1-4）。29例（52%）患者在TBC之前或之后额外进行了钳夹活检，中位穿刺次数为6（1-15）。关于支气管镜检查的详细信息见表2。TBC的总体病理诊断率为98%（55/56），钳夹活检没有额外的诊断率。1例未能通过支气管镜成功诊断的患者最终通过胸腔镜手术被诊断为腺癌（表3）。在29例同时接受TBC和钳夹活检的患者中，冷冻活检和钳夹活检获得的组织表面积之间有显著差异（p<0.001）。

表2

表3

在使用1.1 mm冷冻探针进行TBC的56例患者中，3例（5%）发生了操作相关并发症。3例并发症均为冷冻活检后大量出血，均经球囊止血成功控制。所有患者均预防性使用抗生素，未发生与操作相关的肺部感染。所有患者均未出现医源性气胸等危及生命的并发症。

NGS结果：

使用1.1 mm冷冻探针的TBC采集的组织标本，基于DNA和RNA进行NGS测序的诊断率均为95%（53/56）。在检测到的突变中，仅考虑了在癌症体细胞突变目录（COSMIC）数据库中注释的突变。在84个基因中发现突变，常见的基因有：TP53（59%）、EGFR突变/扩增（38%）和MET（23%），如图1所示。只有1例患者没有突变，52例（98%）患者存在1个以上突变（范围：1-24；中位数：3）。在NGS结果阳性的53例患者中，29例（55%）携带可作为治疗靶点的突变。已报道突变的详细信息见表4。

图1

表4

3例NGS检测失败的病例中，2例经TBC病理确诊；然而，组织的数量不足以进行NGS分析（表3和图2）。在另一个患者中，最初进行了经胸穿刺活检，病理报告为“广泛的凝固性坏死伴少量异型细胞”，这是无法诊断的。为了确定诊断和进一步的分子检测，使用1.1 mm冷冻探针进行了后续TBC；然而，只获得了坏死物质，因此无法进行组织学诊断。患者最终通过胸腔镜手术诊断为低分化腺癌，并成功行NGS检测。

图2

讨 论

据研究者所知，这是第一项探讨使用1.1 mm冷冻探针行TBC用于NGS分析的适用性的研究。基于DNA和RNA的NGS测序的诊断率均为95%。迄今为止，免疫组织化学、PCR和荧光原位杂交等单一生物标志物检测已被用于精准肿瘤学时代。然而，在临床实践中，需要扩大多重检测的靶向分子生物标志物列表，尤其是NGS。NGS已被证明是一种有价值和可靠的方法，用于肺癌的诊断、靶向治疗决策和致病机制的确定。然而，对于晚期肺癌，小活检标本的组织产量往往是一个相关问题。因此，在晚期肺癌患者中，寻找一种能够以最小的并发症获得最大数量的组织的方法至关重要。本研究结果表明，使用1.1 mm冷冻探针的TBC是一种有用且安全的用于NGS分析的组织采样方法。

亚洲个体化医学肺癌基因组筛查项目（LC-SCRUM）最近的一项研究报告了使用各种采样方法进行NGS的成功率，包括经支气管钳活检（n=110）、EBUS引导下经支气管穿刺活检（n=42）、计算机断层扫描引导下活检（n=15）、液体样本（n=14）和手术活检（n=42）。该研究报道的NGS分析成功率分别为83%、83%、71%、100%和94%，提示如果可能，应优先考虑手术活检。然而，本研究表明，在使用1.1 mm冷冻探针的TBC和LC-SCRUM的历史对照手术活检之间，NGS检测的诊断率无显著差异（分别为95% vs. 94%）。

冷冻技术以其获得更大活检样本的优势被引入肺癌诊断领域后，最近有报道使用TBC获得的组织样本进行NGS分析。在使用冷冻技术进行NGS检测的所有3项研究中，均使用了直径1.9 mm的冷冻探针。Arimura等人报道，在相对较少的患者（n=23）中，冷冻活检的组织学诊断率为87%，并且在17例患者中成功进行了DNA测序。Udagawa等人报道了全外显子组和RNA测序的成功率分别为90%和75%（n=18）。Kinoshita等人最近的一项研究报道了使用TBC的NGS的成功率为100%（n=26）。与直径1.9 mm冷冻探针的组织学对照相比，本研究中NGS检测的诊断率无显著差异。此外，直径1.1 mm的冷冻探针易于插入到更外围的区域，并且足够灵活，可以引入支气管弯曲角度较大的地方，如上叶的顶端段。

本研究中RNA测序的成功率与DNA测序的成功率相同（均为95%）。基于RNA的NGS是一种创新技术，被推荐用于最大限度地检测融合事件，在国际指南和最新报告中也得到了强调和推荐。与DNA不同，RNA极不稳定，容易降解。因此，RNA降解是NGS的主要挑战。RNA的质量和数量取决于样本的类型，一些研究报告了RNA测序的诊断率相对低于DNA测序。然而，在本研究中，使用1.1 mm冷冻探针行TBC获得的样本进行DNA和RNA测序显示了相同的诊断率。考虑到使用1.1 mm冷冻探针行TBC的DNA和RNA测序的高诊断率、低并发症发生率（5%）以及无需全身麻醉，清醒镇静下TBC可能是比外科活检或其他支气管镜取样技术（如钳活检或穿刺活检）更适合NGS的诊断流程。

有人担心冷冻活检会导致大量出血。在之前，研究者在一项纳入50例患者（其中大多数为早期肺癌）的前瞻性观察性研究中报告了TBC的安全性。虽然26%的病例出现中度出血，但研究者成功地控制了所有出血事件，没有任何危及生命的并发症。Nakai等认报道，磨玻璃结节的出血发生率高于实性病变（分别为47% vs. 8%）。由于本研究的研究对象多为晚期肺癌患者，遇到的实性病变比例可能高于既往研究的早期肺癌患者。因此，在本研究中，大量出血的发生率为5%，低于既往报道。本研究结果提示TBC在晚期肺癌NGS检测中具有重要作用，且具有可接受的安全性标准。

本研究有一些局限性。首先，这是一项单中心研究，患者数量相对较少。虽然本研究使用了前瞻性收集所有连续患者的支气管镜检查登记系统，但可能的选择偏倚可能影响了结果。其次，虽然该队列计划的TBCs数量为3，但分析最佳TBCs数量是不可行的。然而，研究者可以推断，第一次TBC比第二次或第三次冷冻活检更关键，因为它提供了更大的组织表面积。第三，虽然大多数患者的疾病分期为III期和IV期，但研究者更倾向于使用TBC进行外周肿瘤采样，而不是使用凸形EBUS进行淋巴结采样。在56例患者中未观察到大结节。24例患者怀疑隆突下淋巴结转移，最长径平均为15.9 mm，最短径平均为10.9 mm。但EBUS-TBNA与TBC的NGS性能差异尚需进一步分析。第四，本研究未使用新型支气管镜技术，如锥形束CT辅助、电磁导航支气管镜、机器人支气管镜和额外穿刺活检或大口径冷冻探针的多模式组织取样。这些技术有可能提高二代测序的产率。部分患者在TBC之前或之后使用1.1 mm冷冻探针进行活检。之前的钳活检可能对1.1 mm冷冻探针的TBC诊断率产生了积极或消极的影响。为了验证本研究的冷冻技术在NGS检测中的结果，需要一项具有统一协议的大规模前瞻性研究。

本研究表明，使用1.1 mm冷冻探针行TBC获得的组织样本适用于基于DNA和RNA的NGS测序分析，且不会出现任何危及生命的并发症。这些发现可能有助于精准医疗在肺癌患者中的应用。

参考文献：

Kim, Mi-Hyun et al. “Next-generation sequencing using tissue specimen collected with a 1.1 mm-diameter cryoprobe in patients with lung cancer.” Respirology (Carlton, Vic.) vol. 29,4 (2024): 333-339. doi:10.1111/resp.14680