allo-HSCT后供者细胞上的抗原表达缺失或下调了？

01

案例经过

案例一

患者，女性，42岁，2021年4月2日主因“发现白细胞升高2日”入院。骨髓穿刺涂片示：有核细胞约>200个/HP，增生极度活跃，G：E=0.76：1。单核细胞占55.2%，其中原始、幼稚细胞占33.8%，此类细胞胞体较大，多呈类圆形或不规则形，胞浆量丰富染灰蓝色，胞核多呈类圆形及扭曲折叠形，核染色质疏松，核仁隐约至明显可见，部分细胞浆内可见紫红色的细小颗粒。

原始、幼稚细胞特殊化学染色：POX 5%(-)18%(+)77%(++)，DCE：6%(-)94%(+)，PAS：约95%的细胞呈弥散状阳性，ANAE：100%的细胞呈弥漫至块状棕红色阳性，ANAE+NaF：阴性，抑制率100%。

检查意见：本次涂片考虑AML-M5可能骨髓象。骨髓流式：异常髓系幼稚细胞占有核细胞总数25.69%，其免疫表型为CD45dim+CD64bright+CD33bright+CD13+CD38+HLA-DR+CD14-CD56part+CD15part+CD11b-CD300e-。

骨髓染色体：47，XX，t(9；11)(p21；q23)，+der(9)t(9；11)(p21；q23)[19]。融合基因：MLL-AF9阳性（98.616%）。该患者诊断为AML-M5（MLL-AF9）。

于2021年7月8日输注中华骨髓库无关供者的外周血造血干细胞，+13d巨核系植入，+15d粒系植入，+32d供者完全嵌合。在+15d的骨穿复查中，形态和流式均未见异常，但流式显示正常中性粒细胞CD16完全不表达，将CD16-PC7换为另一厂家的CD16-BV605，同样不表达。

截止至撰稿日，患者持续维持在供者完全嵌合状态，移植后共进行了5次骨穿，流式均显示粒细胞CD16完全不表达。流式图如下：图中蓝色代表中性粒细胞群体，图1、2分别为初诊和化疗后2.5个月，图3、4分别为移植后+15d和撰稿前最近一次骨穿。

图1

图2

图3

图4

案例二

患者，男性，57岁，因“确诊T大颗粒淋巴细胞白血病2年半，乏力不适10日”于2021年8月30日入我院。入院后查骨髓，涂片示：有核细胞极度低生，偶见胞浆内颗粒相对较多的淋巴细胞，所见粒、红、巨核三系细胞形态未见明显异常（部分稀释不排除）骨髓象。

骨髓流式：异常T淋巴细胞占有核细胞总数8.28%，其免疫表型为CD45bright+CD3+CD8dim+CD2dim+CD5-CD7-CD4-TRBC1-TCRαβ+CD95+CD16dim+CD11c+CD57part+CD26-PD-1+CyCD3+CD45RApart+CD45ROpart+TCRγδ-CD56-CD94few+CD52part+CD28-CD30-ALK-。

外周血流式：异常T细胞占有核细胞9.45%，免疫表型同骨髓，流式符合T大颗粒淋巴细胞白血病（T-LGL）表型。

2022年1月4日，回输亲缘半相合（女供父）异基因造血干细胞，移植后+10d巨核系植入，+13d粒系植入，+19供者完全嵌合。在移植后+14d的骨穿复查中，形态和流式均未见异常，但流式显示97.70%的正常T细胞不表达CD5，将CD5-PB450换为CD5-PECy5.5（图5-6）再次进行实验，结果相同。

图5

图6

我们又进一步排除了供者（女儿）T细胞的问题（图7）。移植后+25d再次骨穿中，正常T细胞中92.40%表达CD5（图8），其它免疫表型未见异常。

图7

图8

流式图：绿色和红色分别代表正常T细胞和异常T细胞，图9-10分别为初诊和移植前，图5-6为移植后+14d分别用CD5-PB450和CD5-PC5.5检测结果，图7为其供者外周血，图8为移植后+25d检测结果。

图9

图10

02

案例分析

“案例一”患者移植前中性粒细胞正常表达CD16，目前已是移植后7个月，患者处于供者完全嵌合、AML完全缓解状态。在移植后的5次微小残留病灶（MRD）监测中，流式除发现粒细胞CD16表达完全缺失外，其余并无异常，为排除克隆号或荧光素的因素，我们更换了不同厂家的抗体（荧光素也不同）进行检测，结果一致。

“案例二”患者原发病为T-LGL，移植前异常T细胞群体不表达CD5，当移植后+14d监测MRD时发现CD5几乎缺失（CD3+CD5+仅2.30%），引起了分析人员注意，然而其它T细胞抗原（CD2、CD7、CD8、CD4）和鉴别T细胞克隆性的抗原（CD45RA、CD45RO、TRBC1）均无表达异常，不免使人困惑。

我们先后采用CD5-PECy5.5和CD5-FITC对患者标本及供者（女儿）外周血细胞进行验证，排除了实验操作和试剂的问题。更有趣的是移植后+25d虽然还有7.60%的T细胞不表达CD5，但其CD5表达有趋于正常的趋势，这种移植后正常细胞上某个抗原表达明显下调，随后又逐渐恢复的现象，目前在其他移植后的患者中并未出现过。

03

心得体会

CD16抗原是流式细胞术检测粒细胞发育阶段的常用标志，它的本质是FcγⅢ类受体（FcγRⅢ）。FcγR受体主要有三类：FcγRⅠ（CD64）、FcγRⅡ(CD32)和FcγRⅢ（CD16），FcγR受体通过识别IgG的Fc端起到连接体液免疫和细胞免疫的桥梁作用。

FcγRⅢ由位于1q22染色体上的FcγRⅢA和FcγRⅢB两个同源的基因编码。FcγRⅢA主要表达于NK细胞、单核细胞和巨噬细胞，编码FcγRⅢ的穿膜结构。FcγRⅢB则表达于中性粒细胞上，编码FcγRⅢ磷脂酰肌醇锚定连接受体。FcγRⅢB基因缺失时中性粒细胞CD16表达发生改变，但NK胞的CD16表达不受影响。

FcγRⅢB基因缺失（或可称为多态性）在健康人群中有一定的比例，国内罕有报道，国外报道的案例中大部分为正常健康年轻女性，这类女性生育时体内会产生母源性的抗FcγRⅢ抗体，导致新生儿免疫性中性粒细胞减少而被发现存在FcγRⅢB基因缺失。

FcγRⅢB基因缺失的个体并无自身免疫病发生率增加、容易感染或发生重度感染的倾向，可能是因为中性粒细胞上另一种受体—FcγRⅡa的存在，后者可以单独承担起正常中性粒细胞的防御功能，通常情况下这两类受体共同参与IgG调控的中性粒细胞吞噬颗粒活动。我们推测“案例一”供者可能存在FcγRⅢB基因缺失。

CD5作为泛T抗原，它在αβ和γδT细胞上均表达，在T细胞发育的早期双阴性阶段（CD4-CD8-T细胞）即可检测到，随着T细胞发育成熟表达增强。以前认为CD5正调控T细胞和T细胞受体（TCR）的活性和功能，但新近的研究表明CD5既是TCR信号的负调节因子，也是T细胞存活的启动子，CD5已被证明参与免疫系统免受自身攻击、免疫耐受的过程，包括负选择、无效诱导、诱导细胞死亡和调节性T细胞（Treg）的产生等，说明CD5不仅是一种表面标志，也是具有免疫负调控功能的分子。

“案例二”为什么会出现移植后一过性CD5表达下调，我们没有找到相关文献，咨询了几个承担较多异基因移植后样本检测的实验室，均表示未遇到过这类情况，因此目前先报道此现象，未来持续关注。

04

结 语

造血干细胞移植后进行MRD流式监测的患者中，偶尔会发生某个抗原表达减低或丢失的情况，此时需排除仪器、试剂和人员操作的问题，给出结论时应结合其他抗原的表达情况综合分析判断。截止到撰稿日，本文的2个案例MRD持续阴性，在结果报告中我们分别对CD16和CD5的表达情况进行了单独描述，告知临床的同时也提醒流式分析人员，每一次跟踪随访都需密切关注有特殊表达改变的抗原，这类抗原的表达变化或可作为一种标志物提示患者的疾病状态。

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