欧洲血液学杂志：TEC与BTK抑制剂出血副作用无关

Tec酪氨酸激酶是一种胞质内的蛋白酪氨酸激酶，在淋巴细胞发展和活化阶段，Tec激酶在抗原受体的下游传导路径中发挥着重要的作用。在BTK抑制剂中，无论是First in Class的Ibrutinib还是最新的Acalabrutinib，亦或是尚在临床试验中的Zanubrutinib都显示出一定的抑制作用。一些宣传认为TEC是BTK抑制剂出血副作用的主要原因，对其相对抑制力较弱的BTK抑制剂，其出血的副作用越小。事实真是如此吗？TEC真的与出血具有直接的联系吗？近期，欧洲血液学杂志发表了最新的人体细胞研究，结果与体外研究结果恰恰相反，TEC抑制强度与血小板聚集力没有直接关系，而BTK抑制的强度才与此有关，如果没有出血的副作用，可能对BTK的抑制效果反而需要打个问号了……

早先的体外研究

BTK与血小板凝聚相关

早在1998年，Current Biology杂志就发表研究（Current Biology 1998, 8:1137–1140）：BTK参与血小板活化过程，是胶原受体糖蛋白（GP）IV活化的上游通路。且通过实验显示BTK与胶原蛋白诱导的血小板凝聚相关。

2003年，BLOOD杂志发表相关研究(Blood. 2003 Nov 15;102(10):3592-9)，选取XLA（因BTK发生突变造成的无丙种球蛋白血症）疾病患者的血小板以及BTK-敲除的小鼠血小板进行检测，结果显示血小板聚集量相对正常对照组明显减少，且与其对应的是低浓度的胶原蛋白，但在高浓度胶原蛋白下，血小板聚集水平能够恢复接近正常：

若BTK敲除 ：   

BTK↓ → 胶原蛋白↓ → 血小板聚集↓

若增加胶原蛋白： 

BTK↓ → 胶原蛋白↑ → 血小板聚集↑

因此进一步验证：

BTK通过GP IV通路，控制胶原蛋白，进一步控制血小板聚集

BTK → 胶原蛋白 → 血小板聚集

BTK/TEC与血小板凝聚

众所周知BTK/TEC有协同作用，那两者对血小板聚集是否也有协同作用。在Blood研究中发现，若小鼠的BTK/TEC同时被敲除，其血小板聚集能力确实显著下降，胶原蛋白需要继续升高至10μg/ml才能让血小板聚集能力开始有所恢复。因此认为在小鼠体内，TEC可部分代偿BTK功能的功能，并就此推断对TEC抑制会造成血小板聚集能力更严重下降。

BTK/TEC同时敲除的大鼠，其血小板凝聚力进一步下降

体外研究缺陷：

● 只评估IC50在体外进行血小板化验来测量，并且没有考虑到每一种BTK抑制剂所表现出的不同临床意义的人类血浆暴露水平（如一些BTK抑制剂需多次服用，导致在血浆中暴露的水平更高）。

● 对BTK抑制剂所定义的体外潜能进行简单的比较，可能会导致在临床环境中得出不准确的结论。

本次欧洲血液学杂志针对体外研究的缺陷，进行了人体细胞的研究，主要针对三个方面：

1、激酶的选择性，寻找是否具备BTK选择性更强的抑制剂

2、靶标的选择性，检验哪个BTK抑制剂具有较强OFF-TARGET

3、出血的副作用，是否是TEC抑制造成了使用BTK抑制剂出血的副作用

欧洲血液学杂志发表研究

1、激酶检测

BTK抑制剂：

ibrutinib, acalabrutinib, tirabrutinib, RN486, and zanubrutinib

检测方法：

1、Caliper LabChip：微流体移动移位分析

2、HotSpotSM：放射性同位素过滤结合试验

3、LanthaScreen™ ：荧光共振转移测试

4、KINOMEscan：活性位点定向检测分析

应用四种不同的检测方法检测相应BTK抑制剂在对于BTK及TEC的抑制强度

检测结果：

不同分析平台显示，其结果也并非得到一致性的结果，在BTK抑制能力方面，伊布替尼较Acalabrutinib在三个平台上均体现出其对BTK强大的抑制能力。

However, ibrutinib was consistently more potent than acalabrutinib in all three catalytic activity platforms that measured on-target BTK activity, with IC50 values ranging from 0.13 to 1.18 nM, in contrast with 2.79 to 135 nM for acalabrutinib.

在对BTK选择性分析方面在四种检测中各不相同。在LabChip®和KINOMEscan®检测中, ibrutinib 与acalabrutinib在TEC/BTK的比值上均不到两倍，从数值上看Acalabrutinib相较对BTK有着略高的选择性，但是两者没有达到统计学差异。但与之相反，在LanthaScreenTM 以及TRFRET HotSpotSM这两个检测平台上，Acalabrutinib对BTK的选择性低于在Ibtutinib，并且有显著的统计学差异。

In the LabChip® and KINOMEscan® assay, the difference in the TEC/BTK ratio between ibrutinib and acalabrutinib was less than two-fold, with acalabrutinib being slightly more selective for BTK, although the differences did not reach statistical significance. In contrast, acalabrutinib was much less selective than ibrutinib in the LanthaScreenTM TRFRET and HotSpotSM assays and the differences were statistically significant.

而在LabChip®平台对多个BTK抑制剂进行比较（包括对BTK具有超高选择性的RN486），研究发现Ibrutinib对BTK的效力比其他共价BTK抑制剂更有效，并且在所有四种抑制剂中具有最高的效应。而检测显示，对于BTK靶向的选择性方面，几个BTK抑制剂并没有差异。因此，在多个检测分析平台上并无法证明，Acalabrutinib等其他新BTK抑制剂对BTK具有更强的选择性。

Thus, we were unable to demonstrate that Acalabrutinib was significantly more selective towards BTK over TEC compared with ibrutinib using multiple assay platforms.

2、靶标研究

研究对BTK抑制剂进行了相关细胞分析。

BTK靶标：

1、CD69：在B细胞中，BCR-介导的CD69已被证明是独立依赖于BTK增殖。

2、TMD8细胞：一种ABC-DLBCL细胞株，已被证实依赖于BTK活动增殖。

因此，通过测量在DoHH2细胞和人的血液中的CD69，以及测量TMD8细胞的生长抑制，来评估BTK抑制剂的靶细胞活性。

脱靶靶点：

利用T细胞受体（TCR）——由Jurkat急性T白血病细胞的刺激IL-2分泌，以及Jurkat和A549肺腺癌细胞的扩散分析，对BTK抑制剂的off-target进行了评估。

结果显示，所有BTK抑制剂均在BTK上显示了有效的活性，而Ibrutinib显示出最大的效应。而在脱靶点上，几个BTK抑制剂并未有体现统计学差异。但值得注意的是，Ibrutinib减少了Jurkat T细胞的IL-2分泌，即便细胞数量增加到3 μM以上，这也可能是由于Ibrutinib多靶点针对ITK起效的原因。

3、血小板聚集与BTK、TEC的关系

研究随后进一步确定BTK和TEC活性对胶原蛋白诱导的血小板聚集的相关性。

在多个健康者血小板聚集分析中测量四种BTK抑制剂的IC50值。Ibrutinib的平均IC50是(0.35 ± 0.07)μM（n=7），这与先前的报告一致。与此相反，acalabrutinib与tirabrutinib的IC50值分别为1.85μM和3.15μM，相对血小板聚集抑制减少。但是需要注意的是，相对一天一次口服的Ibrutinib，acalabrutinib与tirabrutinib这两个化合物表现出更高的临床药物血浆暴露水平（Acalabrutinib临床剂量100mg，每日两次）。稳态Cmax水平，Acalabrutinib与Tirabrutinib分别为1.78和2.76μM；Ibrutinib则为0.31μM，每天一次420mg/d。（Zanubrutinib在使用80mg/d的IC50为0.44 ± 0.10 μM，其Cmax水平为0.37 μM, 在LTA分析中，也证明了Cmax和IC50之间的密切关系。）

从每个药物的Cmax以及各自的IC50值来看，用药后，每个BTK抑制剂的水平稳态Cmax浓度均接近其IC50值，并在临床环境中对血小板聚集进行的抑制。

研究证实，在B细胞中血小板聚集和CD69诱导的效力之间存在明显的相关性，与BTK活动明显相关。与此相反，TEC与血小板聚集并无直接关联（见下图），这表明BTK在调节信号传导在诱导人类样本中的血小板聚集方面起着主导作用。

★ 欧洲血液学杂志研究报道总结 ★

1、激酶的选择性：BTK抑制剂在四个不同检测平台上对BTK与TEC选择性检测的结果并不相同，因此多个检测分析平台上结果的不同，暂时并无法证明哪种BTK抑制剂具有更强的BTK选择性。

2、靶标研究：所有BTK抑制剂均在BTK上显示了有效的活性，而Ibrutinib显示出最大的效应。而在脱靶点上，几个BTK抑制剂之间比较并未有体现统计学差异，因此无法对所谓的脱靶状况进行描述。

3、出血的副作用：研究确认血小板聚集与BTK活动明显相关。并进一步证明，TEC与血小板聚集并无直接关联，这表明BTK在调节信号传导在诱导人类样本中的血小板聚集方面起着主导作用，BTK抑制性越强对血小板聚集抑制可能越强，而非所谓的脱靶TEC效应导致的BTK抑制剂出血的副作用。