N6-脱氧腺苷甲基化(6mA)是原核生物中最广泛的DNA修饰类型，也大量分布在单细胞真核生物中。然而，哺乳动物体内的6mA含量非常低。由于缺乏精确和全面的测绘方法，阻碍了对6mA进行更深入的研究。
2022年12月27日，中山大学骆观正团队在Cell Discovery在线发表题为“High-precision mapping reveals rare N6-deoxyadenosine methylation in the mammalian genome”的研究论文，该研究通过高精度图谱揭示了哺乳动物基因组中罕见的N6-脱氧腺苷甲基化。该研究报道了一种基于新检测原理的全基因组6mA映射新方法MM-seq(修饰诱导错配测序)。该研究发现修饰后的DNA碱基容易形成一个局部开放区域，允许抗体捕获。特定的内切酶或外切酶可以识别抗体稳定的错配样结构，并标记准确的修饰位点，以便测序读出。
利用这种方法，该研究检测了6mA在细菌(大肠杆菌)、绿藻和哺乳动物细胞(HEK239T、Huh7和HeLa细胞)中的基因组位置。与细菌和绿藻相比，人类细胞拥有非常有限的6mA位点，它们零星分布在不同细胞类型的基因组中。在敲除小鼠ES细胞中的RNA m6A甲基转移酶METTL3后，6mA大部分减少。总之，该研究结果表明哺乳动物基因组中罕见的6mA是由RNA m6A机制通过非靶向机制引入的。
N6-脱氧腺苷甲基化(6mA)是一种普遍存在于原核生物中的DNA修饰形式，也存在于一小群单细胞真核生物中。但关于6mA鉴定和功能研究的研究很少，目前支持6mA作为高等真核生物表观遗传调节因子的证据有限。通过液相色谱-质谱(LC-MS/MS)测定的总体6mA水平在哺乳动物中变化很大，从相对较高(相当于5mC)到无法检测到的水平。
尽管LC-MS/MS被认为是检测和量化核苷酸修饰的金标准，但修饰的序列信息仍然未知；因此，来自环境或人为干预的污染可能产生人工信号。此外，最近的研究提出，痕量N6-甲基腺嘌呤通过核苷酸挽救途径误并入DNA，该途径从RNA降解代谢产物中回收修饰的腺苷。另一方面，尽管某些研究认为6mA是高度动态的，在胚胎发生或DNA损伤反应等特定生物过程中显著升高，但另一些研究认为在大多数情况下，总体6mA水平极低。
与LC-MS/MS相比，基于测序的方法可以识别与其序列上下文相关的修饰碱基，这有助于全面的全基因组分析以及下游功能研究。甲基化DNA免疫沉淀(IP)结合深度测序(MeDIP-seq)已经成为分析DNA修饰(如6mA)最流行的方法，其工作原理是利用抗体的特异性亲和力来富集修饰DNA片段。无论如何，人们担心抗体特异性的偏差可能会产生假阳性信号，并高估一些样本中的6mA化学计量值。对于低6mA水平的种，假阳性率空前高，严重影响了后续的功能分析。最近的一份报告估计，由于抗体的非特异性结合，很大一部分峰值(50%-99%)可能是假阳性。
MM-seq在哺乳动物细胞系中的应用（图源自Cell Discovery ）
另外，一些限制性内切酶能够以高灵敏度和特异性确定特定位点的修饰状态。然而，基于限制性内切酶的全基因组方法仅限于具有一致序列基序的基因组区域的子集。第三代测序技术，包括PacBio单分子实时测序(SMRT-seq)和Oxford Nanopore Technologies (ONT)，允许在单碱基分辨率下检测全基因组DNA修饰。尽管第三代测序已成功应用于细菌和绿藻，但已知一致序列的高错误率和前提条件阻碍了其在检测植物和哺乳动物中低修饰位点的应用。总的来说，开发一种敏感而可靠的定位方法来确定6mA的存在以及基因组中真正6mA位点的精确位置是至关重要的，特别是对于具有非常低6mA水平的生物体。
在这项研究中致力于开发一种无偏倚的方法来全面和精确地绘制多个物种的基因组6mA位点。该研究证实了基于双链体DNA的N6 -脱氧腺苷促进了一种错配样结构，可能是通过DNA呼吸或碱基翻转机制。这种独特的错配样结构使6mA被6mA特异性抗体捕获，随后被某些核酸酶或化学裂解反应识别。根据这一原理，该研究开发了一种新的映射方法MMseq(修饰诱导错配测序)，并将该方法应用于细菌和绿藻，获得了精确的全基因组6mA单碱基分辨率图谱。然后，该研究检测了有限数量的6mA位点，并检测了多种人类细胞系中的分布模式。
值得注意的是，在不同的技术和生物学重复中，罕见的6mA位点的不重叠分布表明了6mA生物发生的非靶向机制。
原文链接：
https://www.nature.com/articles/s41421-022-00484-1
来源：iNature
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