基因疗法：失望与希望
什么是基因？基因是一段由脱氧核糖核酸（DNA）或核糖核酸（RNA）编码的遗传信息。基因可以表达具有生物学功能的大分子，一般是蛋白质，有时候是RNA。人类基因组有三十亿个碱基对，其中大概只有2%的碱基序列编码基因。科学家估计人体大概有两万个基因。这些基因并不是孤立的模块，而是在基因网络构成的遗传背景之上发挥作用。人们很早就认识到有些疾病是可遗传的。换言之，这些疾病的起因在于基因编码了错误的功能分子。 理论上，如果人类能改造致病基因，不就可以根治很多疾病了吗？
许多常见的慢性疾病，如
心血管疾病、
糖尿病、精神分裂症等，与多个基因有相关性。随着科学研究的进展，特别是基因组学的爆发，与这类疾病相关基因的名单在不断变长，而生理机制的研究往往相对滞后。目前一般认为这类疾病无法在基因层面治疗。
基因疗法最有前景的领域，是所谓的单基因疾病，这类疾病的因果关系清晰，理论上一个问题基因修复起来也最简单。但从这个想法出现，到成为正式上市的疗法，用了超过三十年的时间。为什么一个简单的逻辑实现起来会需要这么久呢？
我们先回顾一下中学生物教科书的内容。健康人有二十三对染色体，包括二十二对常染色体和一对性染色体。异常基因与正常基因的主次关系可分为显性和 隐性。如果异常基因表现为显性，一般意味着这个基因编译的蛋白质执行了有害的异常功能，而正常基因不足以抵消这种危害。所以携带一个异常基因就会出现病状，而同时携带两个拷贝则病情加重。典型的显性遗传病如SOD1基因变异造成的肌萎缩侧索硬化症，也就是俗称的渐冻人症（ Amyotrophic lateral sclerosis，ALS）。
如果是隐形，大多是因为正常的蛋白活性降低或彻底消失。再细分下去，又可能是因为单个蛋白分子活性降低，或蛋白分子的数量减少，或二者兼而有之。如果两个等位基因中有一个是正常的，那么正常拷贝可以在一定程度上挽回局面，这种人我们称为携带者，携带者一般没有症状。只有当两个等位基因都出了问题，才会导致显着的症状。隐形遗传病的例子如苯丙酮尿症（Phenylketonuria，PKU)，致病基因不能合成代谢某种氨基酸所必需的酶。
对隐形致病基因，修正的逻辑是“缺什么补什么”。在没有基因疗法之前，只能补充病人缺少的蛋白因子。一个成功的医学案例是由凝血因子缺失导致的血友病。只要向病人体内输入外源的凝血因子，就可以令其生活质量长期维持在接近健康人的水平。血友病患者是遗传病群体中的“幸运儿”。除了本身是隐形疾病之外，血友病还有两大“优势”。第一，凝血因子可以在细胞外的
血液循环系统中直接发挥作用。而苯丙酮尿症患者缺少的酶需要在细胞内才能实现其功能。要知道，外源蛋白制品一般是无法被运送到细胞内的。第二，凝血因子可以在体外大批量制备。早年凝血因子必需从献血者的血浆中提取，现在也可以人工合成。蛋白质在体内一段时间后会被代谢降解，因此病人必需反复输入凝血因子。这不仅增添了病人的负担，还带来额外的风险。1980年代的艾滋病高峰期，美国的血友病群体因此面临两难：输入
血液制品，可能因此
感染艾滋病；不输入血液制品，可能会失血致死。
在第一个基因编辑婴儿已经诞生的今天，人们很容易忘记，人类初次获得基因改造的能力是并不是遥远的往事。1972到1973年，美国斯坦福大学和加州大学旧金山分校的科学家首次报道了重组DNA技术：人类终于可以改造细菌和噬菌体等简单生物的基因组了！随着重组DNA技术一同问世的，还有严肃的伦理拷问：人类将如何运用改写遗传物质的能力？ 1975年，一百多名科学家，以及若干记者和律师聚集在加州阿西洛马（Asilomar)会议中心，召开了针对重组DNA技术安全性的阿西洛玛会议。会议上达成
共识：科学家在设计编辑基因的实验时，要优先考虑如何控制潜在的风险。阿西洛马会议组织者透明的作风促成科学研究和公众讨论的良性互动。公众对生物学前沿产生了极大的兴趣， 而科学家获得了所需的自由度开展基因改造的研究。
没有生物学研究经验的人可能不会意识到，修改体外培植的细胞的基因和修改活体内细胞的基因是两件很不一样的事。简单地说，体内可行的技术都可以用于体外，反过来就不一定了。如果我们想把外源基因导入生长在培养皿中的细胞，只需要用电或化学载体令DNA通过一层细胞膜就可以了。然而大部分人体细胞都是存在于三维的组织中，一个细胞接着另一个细胞，让电场或化学载体精确作用于目标细胞上几乎是不可能的。
自然界中有一种善于跨域细胞膜的微生物：病毒。病毒的结构非常简单：一段携带病毒遗传信息的DNA或RNA，加上包裹遗传信息的蛋白质外壳。病毒不是细胞，不能独立分裂，必需寄生在宿主细胞内才能自我复制。新组装的病毒达到一定数量后，有些病毒会直接将宿主细胞裂解，有些病毒会选择温和一点的做法，再次穿过细胞膜到达细胞外。被释放的病毒会继续
感染周边的细胞，如此循环往复。对宿主而言，病毒的复制是以自身健康为代价的。这时候
免疫系统会与病毒开展一场激烈的搏斗，宿主会出现炎症反应。搏斗的结果可能是宿主胜利，病毒被清理掉，也可能是病毒胜利，宿主的正常生理机能不断衰竭甚至死亡。艾滋病病毒之所以一度难以克服，正是因为它直接入侵
免疫细胞。
科学家想到，如果可以将需要添加的基因片段插入病毒的基因组中，不就可以将其引入活体内的细胞中了吗？显然，天然存在的病毒是不能作为运输基因的载体的，得不偿失。用于基因疗法的病毒需要经过一番改造，令其失去在宿主细胞内复制的能力。载体病毒还要尽可能避免触发免疫反应，不然携带的外源基因还没有到达目标细胞内就被清除了，病人还会因此发烧发炎，甚至出现“免疫风暴”危及生命。向人体内导入病毒毕竟不如口服药物简单易行，必须在医生的监护下进行，为了避免病人隔三岔五上医院，这些病毒需要在细胞内驻留比较长的时间，尽可能减少病人接受病毒注入的次数。一种通用病毒载体最好可以经过略加改造后定向感染肌肉、神经、肝脏等不同种类的细胞，这样可以适应多种基因疗法的需求。
1990年代，美国宾夕法尼亚大学的James Wilson成功地将腺病毒 (Adeno-associated virus，AAV)改造成一种适合基因疗法的载体。利用腺病毒载体，Wilson开展了一些列
临床试验，其中一项实验针对一种罕见的代谢疾病。患者缺少尿素代谢的一种酶，大部分无法活到十四岁。 少年格尔辛基（Jesse Gelsinger）此时已经与这种病搏斗了18年，了解到基因疗法，全家仿佛看到了黎明的曙光。谁知道， 腺病毒载体导致格尔辛基产生了激烈的免疫反应。几天后，格尔辛基的生命永远定格在18岁，这是第一个死于基因疗法的患者。 事后调查发现，宾夕法尼亚大学之前在猴子身上进行的类似试验已经导致实验动物死亡，然而
临床试验并没有及时叫停。 研究人员贪功冒进，没有完全掌握病毒载体剂量的安全范围就用于人体，是导致格尔辛基死亡的主要原因。此外科学家推测，格尔辛基可能曾经被腺病毒的同类病毒感染过，所以他的免疫系统对腺病毒载体反应格外剧烈。这是基因疗法历史上的一次惨痛教训。格尔辛基的悲剧提醒所有的医学研究者：人的生理如此复杂，在试验新疗法的时候，必需战战兢兢，如履薄冰，前期安全评估如何强调都不过分。
从上世纪九十年代到二十一世纪初，大部分基因疗法的临床试验以失败告终。基因疗法的春天还没有到来，就陷入了倒春寒。
基因疗法第一次正式被美国监管部门批准，距离格尔辛基之死已经过了18年。这种叫Luxturna的疗法针对的是一类视网膜类维生素A循环有关的遗传疾病，通过腺病毒载体将一种叫RPE65的酶导入视网膜细胞。在Luxturna出现之前，患者会逐渐失去视力，直至失明。这个案例有个很巧妙的生理学背景：视网膜和主要的循环系统之间存在一定程度的屏障，即使病原体进入眼球，引发的免疫反应也比较小，这叫做“免疫特权”。 现实生活中，我们经常碰到眼睛发炎这种情况。实际上，眼睛这么一大片黏膜长时间暴露在空气中，如果没有免疫特权，天天都会发炎。因此将病毒载体导入眼球内，具有较高的安全性。在不久的未来，我们很可能会听到更多用基因疗法治疗遗传性视觉疾病的好消息。
近年来，大家可能听说过一种叫嵌合抗原受体T细胞免疫疗法（Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy，CAR-T)的新型癌症疗法。CAR-T的工作原理是将病人的T淋巴细胞分离出来，用基因技术在T细胞表面添加一种可以识别癌细胞的嵌合抗原受体，再将编辑过的细胞重新导入病人体内。CAR－T常用的，不仅有腺病毒载体，还有“慢病毒”(lentivirus)载体。 这两种载体最大的区别是，慢病毒载体是一种逆转录RNA病毒，可以将外源基因随机整合到宿主细胞的基因组里，随着细胞分裂可以不断传下去。而腺病毒载体是一种DNA病毒，不干扰基因组，携带的外源基因会随着细胞分裂会逐渐丢失。T淋巴细胞可以被人工分离到体外后进行编辑，所以CAR-T疗法不存在将过量病毒导入人体内的风险。
CAR-T疗法目前是生物技术资本市场的宠儿，已经有两种针对血液癌症的CAR-T疗法得到了美国
FDA的正式批准。目前还有多个CAR-T疗法处于临床试验中，中国本土生物技术公司亦在其列，技术路线林林总总，在此就不赘述细节了。不过参加CAR-T临床试验的病人中已经发生过数起因为免疫风暴死亡的事件。虽然这些病人本身都是危重病人，但是CAR-T疗法肯定还有改善的空间。对普通人而言，最重要的是记住CAR-T是一类疗法的统称，只要技术路线略有不同，都需要单独进行临床试验，证明收益大于风险后才可以得到正式上市。任何新版本的CAR-T在通过临床试验之前，无论公司的前期数据如何出色，都可能以失败告终。
Luxturna和CAR-T都只编辑很小一部分体细胞。体细胞已经高度分化，淋巴细胞不会转为肌肉细胞或神经细胞，更不会转化为
生殖细胞，因此没有遗传给后代的风险。人体内细胞总数以十万亿为数量级，而CAR-T疗法导入人体的基因编辑细胞即使高达上百万，也差了10000000倍！
然而对于显性的遗传疾病，如渐冻人症（ALS），肌营养不良症（muscular dystrophy)， 或遗传性的阿尔兹海默症，其基因突变不仅导致正常的蛋白活性消失，还造成异常的活性出现，“缺什么补什么”这种简单策略行不通。 要根治这类遗传病，需要切除异常的基因拷贝，用正常的拷贝取而代之。
腺病毒载体只能将外源基因导入细胞质中，对基因组没有影响。慢病毒载体虽然可以让外源基因插入细胞本身的基因组中，但插入是随机的，虽然整个基因组中只有2%的序列是直接编码蛋白质的基因，但这个概率已经可能造成正常基因的破坏，这远不足以对满足临床安全性的要求。最关键的是，病毒载体只能添加额外的基因，不能删除、修改已经存在与染色体上的基因。前者好比把一根针丢进稻草堆里，后者就像从稻草堆里挑出一根针，实现起来的难度很明显是不同的，为此我们需要新的工具。
基因编辑的利器：CRISPR
今天我们所说的“基因编辑”，其实指的是“基因组编辑”。如果只是要修改试管中的一段游离DNA，那技术已堪称炉火纯青，实现起来毫无难度。为什么修改基因组会这么困难，而基因组编辑技术被称为近年来生物技术最重要的突破呢？
首先基因组有浩瀚的数据量。人类基因组有三十亿个碱基对，一个基因的编码区很少超过一万个碱基对，而致病的突变可能只牵涉其中数个、甚至单个的碱基对。要定位三十亿分之一的位点，难度显而易见。其次，基因组不是一段裸露的DNA。我们知道DNA具有双螺旋结构。螺旋外侧由糖类和磷酸构成骨架，内侧的碱基互补配对，编码遗传信息。双螺旋缠绕在蛋白质构成的核小体上，看起来像一串念珠。这串念珠又继续折叠成更复杂的三维结构，我们称其为染色质。要编辑某个特定的碱基，首先要看染色质是不是有松散开来的时刻，只有暴露的DNA才是可编辑的。然后要把双螺旋局部拆散，在正确的位置上切一“刀”。 能在分子水平操纵DNA的，自身要小到纳米级别。我们需要的，是一种能自主实现目标定位、解开双螺旋、切断DNA骨架的核酸酶。
迄今为止，科学家发明的基因组编辑工具有三种： ZFN(zinc-finger nucleases)， TALEN（ transcription activator-like effector nucleases）， 和CRISPR( Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)。限于篇幅，这里不介绍ZFN和TALEN，而把重点放在这次基因编辑婴儿事件中万众瞩目的CRISPR上。
CRISPR的基本组件有两个：一个叫做CAS的核酸酶，和一段长约100个碱基的RNA分子，更确切得讲，是引导RNA分子（guide RNA，gRNA）。gRNA中间一般有20个碱基，根据碱基互补识别原则识别目标基因中的一小段序列。gRNA剩余的部分，与CAS绑定在一起。CAS和gRNA双剑合璧，可以把局部的双螺旋解开。然后CAS就在DNA双链上切出一个口子。本来细胞对DNA双链出现切口这种情况是有紧急预案的，负责DNA修复的酶会赶过来在CAS制造的切口上打个补丁。问题是，修复酶的工作不大精细，经常只管把断裂的双链重新连接起来，却不顾本来的序列是什么样子，胡乱删除或添加若干碱基进去。在DNA编译蛋白质的密码本上，三个碱基对应一个氨基酸。如果增删的碱基不是三的整倍数，就会造成移码突变，后续氨基酸序列完全错乱，甚至提前终止。这样原本完好的基因在功能层面等于被删除了。
2013年，来自美国麻省理工的科学家张锋、从乐等人率先报道了用CRISPR编辑哺乳细胞基因组的工作。与此同时，哈佛医学院的George Church团队、纽约洛克菲勒大学的Luciano Marraffini团队也发表了类似的结果。CRISPR最大的优势在于模块化：只要改变gRNA的序列，就可以指向不同的基因。如果同时向细胞中导入多个gRNA，甚至可以同时编辑多个基因。相比之下，操纵ZFN和TALEN需要大量的经验优化。后续研究还发现，CRISPR可以在细菌、真菌、植物、动物等各种细胞和生物活体中工作。从2013至今，科学家对CRISPR/CAS进行了一系列改造，让这把基因剪刀的功能愈发强大。CRISPR1.0主要用于制造“乱码”，而今天的升级版CRISPR已经可以精确修改单个碱基，乃至删除或添加特定的序列。CRISPR的出现，让基因组编辑从一个耗时耗力、需要丰富经验的难题变成了本科生都可以轻松完成的基本实验！CRISPR被誉为近十年内生物技术领域最大的突破，当之无愧。
现在有了CRISPR这个利器，医学工作者是不是可以轻松治疗遗传疾病了？ 且慢，我们到现在还没有讨论一个问题：我们如何知道哪个基因上的某个突变是致病的原因？我们又如何知道修改这个突变可以减轻病痛？
在2018年11月的最后一周， 如果没有基因编辑婴儿事件，生物医药领域最大的新闻本应该是美国FDA首次批准一项基于CRISPR的基因疗法进入临床试验，而申请这个临床试验的，正是张锋创建的Editas。这项疗法针对的是一种叫做Leber先天性黑朦（ Leber's congenital amaurosis， LCA）的罕见疾病。十九世纪七十年代，德国的一位眼科医生Theodor Leber首次描述了这种从婴儿期开始发病、患者逐渐失去视力乃至失明的遗传病。这种病在每十万个新生儿中仅有二三例，进一步的科学研究发现，根据致病基因分类，LCA竟然包括至少十七种亚型！而Editas这次申请的临床试验进针对其中第十种亚型（LCA-10)，占LCA的20%。也就是说，这次临床试验实际针对的，是一种发病率低至百万分之几的遗传病，在欧美国家，患者总数可能仅有数***。LCA-10的致病基因叫做CEP290。 我们之所以有视觉，是因为眼睛中有感光细胞。感光细胞长出像天线一样的纤毛，纤毛中排满了感光蛋白。当CEP290出现缺陷时，感光细胞不能形成正常的纤毛，探测光信号的能力因此受损。
科学家最初是怎么从两万个基因中揪出CEP290的呢？对研究罕见病最有帮助的，是那种明显表现出家族内聚集性的患者。CEP290突变正是从连续出现LCA的魁北克家庭里鉴定出来的。到这一步，CEP290突变只能算得上“嫌犯” 。下一步，科学家还做了一系列实验，证明CEP290的突变的确可以造成LCA：一，从患者身上分离培养视觉细胞，并转入正常的CEP290基因，发现纤毛的形态恢复正常； 二，破坏小鼠的CEP290基因，观察到与人类患者相似的症状；三，用针对CEP290的基因技术修复小鼠的视力。至此我们可以合理推测，如果能修复人类患者的CEP290，就有可能恢复他们的视力。
非专业人士可能会对Editas的新疗法抱有很高的期待，而有经验的生物医学工作者在这个阶段只会表示“谨慎的乐观”。其实任何能进入临床试验阶段的新疗法，其基本原理必然已经通过了论证，然而大部分试验还是死于细节。CRISPR虽然是有史以来威力最大的基因编辑工具，但其准确性和成功率远没有接近百分之百。对实验室中的科学家，这很容易克服：先编辑，再筛选，编辑错误的突变体直接销毁。CRISPR在目标基因之外还可能造成额外的突变，也就是所谓的脱靶问题，这对基础研究并不是严重障碍，但对临床应用就是难以容忍的。在Editas的临床试验中，CRISPR的两个组件CAS和gRNA需要用我们之前提起的腺病毒载体运入感光细胞中。虽然同样用到腺病毒载体的Luxturna已经成功，但具体到每一个治疗方案中，需要的病毒载体数量可能是不同的，对免疫反应的测试必须另起炉灶。为了申请临床试验的资格，Editas补充了在猴子身上的实验。就算通过了安全性测试，这个疗法仍然可能因为CRISPR效率不够高、只能修复一少部分感光细胞的CEP290等种种因素失败。作为一种医疗手段的CRISPR，离正式获得准生证，还有一段相当的路程要走。
目前为止，已经取得较大进展的基因疗法无一例外只改动少量的体细胞。很多遗传疾病，例如肌营养不良症，影响的是难以从人体分离的细胞，而其绝对数量又占人体总细胞数相当大的比例。要根治这种疾病，一种可能的策略是在发育早期编辑基因组。上溯到源头，就是受精卵。人体所有细胞，都由一个受精卵分化而来。如果我们能将CRISPR改造到接近完美的水平，直接编辑受精卵基因组中的致病基因，是不是就可以一劳永逸解决问题呢？对此，科学界的
共识是：我们必须极为谨慎地推进受精卵和
胚胎基因编辑的研究。
生殖细胞中的遗传错误完全有可能复制到全身上下的大部分细胞中，进而传给后代。一个基础研究情境下的“精准基因编辑”，可能用临床标准衡量就是医疗事故。一项蹩脚的应用可以随时被下线。而对一个新生儿，我们没有“再来一次”的机会。更何况，生殖细胞的基因编辑不能消除父母已经存在的致病基因，只能防止下一代出现同样的问题。除非父母一方是显性致病基因的纯合子，或者父母双方都是同一个隐性致病基因的纯合子，否则完全可以通过试管婴儿技术诞下不发病的子女。在考虑改动生殖细胞基因之前，首先应该穷尽药物、手术、辅助
生育技术、体细胞基因编辑等一切替代手段。
来源：澎湃新闻
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2018-09-28
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