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Protein Cell:|李洪林/徐可团队发现靶向宿主DHODH的强效抗新冠病毒候选和临床已有药物

Tags: 新冠病毒   新冠肺炎   强效抗新冠病毒   靶向宿主      更新:2020-08-10

“作为新概念抗新冠病毒药物,二氢乳清酸脱氢酶(DHODH)的抑制剂来氟米特于2020年5月29日获得全球医药创新领域知名公益科研机构英国生命爱科(LifeArc)的全额资助(150万英镑),用于与英方临床专家共同负责开展国际多中心临床试验研究(DEFEAT-COVID study),李洪林教授是该临床试验的发起人和首席科学家,目前已获得英国药品和保健品管理局(MHRA)的临床试验批文,开始在Ashford and St Peters Hospital招募COVID-19病人。”

SARS-CoV-2、SARS-CoV、Zika、MERS-CoV、Ebola、H7N9等RNA病毒在局部地区/世界范围内的大规模爆发流行,给人们的生命健康带来严重危害的同时,也对国家及世界的经济发展带来巨大的冲击。截至目前,新冠病毒已在全球感染达2000万人,并致73万人死亡,但是目前仍没有研制出特效疫苗和抗病毒药物。病毒肆虐之下,寻找治疗新冠肺炎的高效、低毒药物,仍是目前全球范围内对抗新冠病毒的当务之急。

2020年8月4日,华东理工大学药学院/上海市新药设计重点实验李洪林团队和武汉大学病毒学国家重点实验室徐可团队合作在Protein & Cell发表研究“Novel and potent inhibitors targeting DHODH are broad-spectrum antivirals against RNA viruses including newly-emerged coronavirus SARS-CoV-2”,报道了靶向宿主细胞的二氢乳清酸脱氢酶(DHODH)抑制剂能够通过抑制病毒基因组复制和调节免疫两种途径发挥广谱抗病毒药效,且所设计的两个新型DHODH抑制剂S312和S416在细胞水平表现出高效的抗新冠病毒活性,其中S416是目前已报道的体外抑制活性最强的抗新冠病毒候选新药。

病毒的复制周期包括吸附、穿入、脱壳、核酸和蛋白质合成、装配和释放五个步骤。根据现有抗病毒药物作用的对象不同,可将其分为靶向病毒(Direct Acting Antivirals Agent,DAA)和靶向宿主细胞(Host-Targeting Antiviral, HTA)的药物。靶向病毒颗粒的DAA药物是针对病毒复制周期的一个或几个过程而设计的药物,如靶向流感病毒膜吸附融合的药物阿比朵尔、靶向病毒囊膜的药物恩夫韦地和氯喹、靶向冠状病毒(CoV)S蛋白的在研药物GLS-5300、作用病毒脱壳释放核酸阶段的金刚烷胺类抗流感病毒药物、作用病毒核酸复制阶段的药物(如逆转录酶抑制剂拉米夫定、整合酶抑制剂拉替拉韦、RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)抑制剂法匹拉韦和瑞德西韦)、作用病毒蛋白质翻译和装配阶段的药物如HIV蛋白酶抑制剂洛匹那韦、作用成熟子代病毒释放阶段的药物如流感病毒神经氨酸酶抑制剂奥司他韦等。由于DAA药物具有病毒特异性,已有的DAA药物对新发病毒的治疗效果受限或完全无效(如阿比朵尔、氯喹、法匹拉韦,洛匹那韦和瑞德西韦等治疗COVID-19不尽如人意的临床表现),而重新研发新的DAA药物也是“远水解不了近渴”。相比较而言,靶向宿主因子的HTA药物在控制新病毒疫情上具有明显优势。病毒是寄生生物,必须依赖宿主细胞的原料和机器进行核酸及蛋白质生产及加工以完成复制,HTA药物不仅可有效抑制病毒核酸的快速复制,而且能对抗病毒耐药突变,做到“以不变应万变”。因此,具有广谱抗病毒药效的HTA药物研发一直是抗感染新药研发领域追求的目标。但由于此类药物靶向于宿主,需更多考虑安全性及体外-体内药效转化差等问题,因此,此类药物的研发往往事倍功半,劳而少功。

嘧啶碱基是病毒RNA/DNA复制的必需原料,故靶向嘧啶核苷酸合成途径的HTA药物是近年来广谱抗病毒药物的研究热点。针对嘧啶核苷酸合成途径,目前虽有一些活性化合物被报道,但它们大多数没有明确的作用靶点,即便明确了作用靶点,但也基本都以动物体内无效或效果不显着而折戟沉沙。

二氢乳清酸脱氢酶(DHODH)位于线粒体内膜的外侧面,是催化嘧啶核苷酸从头合成途径第四步氧化还原反应的关键酶,那些快速增殖的细胞(淋巴细胞和肿瘤细胞等)或病毒复制,需要依赖从头合成途径来大量合成嘧啶核苷酸以满足细胞增殖或病毒复制对核酸的需求,因此,可以通过抑制DHODH的活性,来抑制嘧啶碱基的从头合成,从而抑制快速增殖的淋巴细胞/肿瘤细胞或病毒的DNA和RNA的生物合成,起到抗自身免疫性疾病,抗癌和抗病毒的作用。以DHODH为靶标的抑制剂目前只有两个FDA批准的药物上市即来氟米特和特立氟胺(即来氟米特的体内活性代谢产物A771726),分别用于类风湿性关节炎和多发性硬化症的治疗。针对DHODH靶点,已20多年无新药上市,近年来虽不断有新型DHODH抑制剂被报道,但是它们多数对DHODH的抑制能力欠缺或在动物模型上未能表现出明显的治疗效果而限制了它们进一步的开发和使用。DHODH靶点虽然具有开发成广谱抗RNA病毒的潜力,但其抑制剂在体内广谱抗病毒方面的应用可行性一直悬而未解。

李洪林团队和徐可团队经过多年的深度合作,联合攻关,在靶向宿主的广谱抗病毒候选药物研究方面取得了重要进展。

李洪林团队前期发展了多种药物设计方法,针对DHODH靶点,设计了两个新型强效候选药物S312和S416,它们在分子水平上抑制DHODH的IC50值分别为29.2 nM和7.5 nM,与DHODH结合的KD值分别为20.3 nM和1.69 nM,且表现出快结合慢解离等良好的成药性质。

联合徐可团队,本文验证这两候选药物与已有DHODH抑制剂——来氟米特(Leflunomide)和特立氟胺(Teriflunomide)均显示出对多种RNA病毒的广谱抗病毒活性,包括A型流感(H1N1,H3N2,H9N2),Zika和Ebola病毒(细胞水平EC50范围为0.013~35.02 μM),且S312和S416体外抗病毒效果均优于特立氟胺。在此文章写作过程中,正值国内新冠疫情爆发,基于前期的研究结果和作用机制分析,合作团队迅速响应开展了针对抗新冠病毒的活性测试。

结果表明两候选药物S416和S312抗新冠病毒EC50分别为0.017 μM(SI > 10505.88)和1.56 μM (SI>101.41)。S416细胞试验抗病毒作用比瑞德西韦(EC50 = 0.77 μM,SI > 129.87)强45倍;比氯喹(EC50 = 1.13 μM, SI > 88.5)的活性强60余倍,是目前已报道的体外抑制活性最强的抗SARS-CoV-2候选化合物。

同靶点的现有老药来氟米特及活性代谢产物特立氟胺,在体外抗SARS-CoV-2病毒的EC50药效(EC50 = 6.001 μM,moi = 0.03;26.06 μM,moi = 0.05),优于法匹拉韦(EC50 = 66.85 μM,moi = 0.05)2倍以上;临床中若通过首日负荷给药,以10 mg/天的低剂量来氟米特便可维持较高的血药治疗浓度,提示老药来氟米特或特立氟胺可能具有较好的抗新冠病毒的临床应用潜力。

为验证DHODH抑制剂在体内广谱抗病毒方面的应用可行性,文章采用了从体内药效验证到DHODH基因敲除到病毒基因组复制量化检测,再到基因组复制所需不同原料补给的实验设计策略抽丝剥茧,最终首次在动物体内证实了DHODH可作为广谱抗RNA病毒的有效治疗靶点。

分别使用甲型流感病毒感染的动物模型、达菲(Oseltamivir)耐药病毒株NAH275Y感染的动物模型及Oseltamivir不敏感病毒株SC09感染的动物模型证实了S312不仅具有与DAA药物同等的功效,并且在对抗DAA耐药病毒时更具优势。

通过使用CRISPR/Cas9基因敲除技术建立DHODH-/-A549细胞系,发现H1N1流感病毒在DHODH-/-细胞株上的增长较WT细胞株而言明显降低且不影响细胞的正常生长,证明DHODH是流感病毒复制所需的重要宿主酶。

使用流感病毒微型复制子系统来量化病毒基因组复制,发现S312和S416通过抑制病毒RNA复制发挥广谱抗病毒作用。

通过向流感病毒微型复制子系统分别添加A, G, U, C四种核苷酸观察其对流感病毒的拯救效果,发现只有添加U和C而非A和G可拯救流感病毒复制被抑制的效果,表明S312靶向嘧啶合成酶;通过分别向病毒复制子系统补充DHODH的底物二氢乳清酸(DHO)和产物乳清酸(ORO),发现ORO而非DHO的加入能剂量依赖性地拯救被抑制的流感病毒复制,表明S312通过靶向DHODH,抑制病毒基因组的复制。DHODH是嘧啶从头合成途径的关键酶,因此,本项目发现的DHODH候选药物若与嘧啶补救途径抑制剂联用,将进一步提高药物的抗病毒活性。

接着,文章在流感病毒感染的重症小鼠体内模型上证实了S312比达菲(Oseltamivir)更具显着优势的治疗效果,进而提出DAA和HTA的组合用药是抗病毒治疗的一种有效策略。在病毒感染中后期(感染后5-9天),达菲已失去治疗效果,而S312仍能发挥50%的小鼠拯救作用,若与达菲联合用药则能发挥100%的拯救效果。

急性病毒感染,如流感、新冠肺炎在感染晚期机体会产生过度炎症反应进而诱发“细胞因子风暴”。文章在流感病毒感染小鼠后第14天检测了达菲与S312联用前后的疾病小鼠肺泡灌洗液,发现DHODH抑制剂可降低IL6, MCP-1, IL5, KC/GRO(CXCL1), IL2, IFN-γ, IP-10, IL9, TNF-α, GM-CSF, EPO, IL12p70, MIP3α及IL17A/F等炎症因子的水平,预示DHODH抑制剂不仅可以有效切断核酸来源抑制病毒复制,还可能抑制过度炎症因子的表达和释放,在感染中晚期起到抗病毒、抗炎双重效果。

本文不仅发现并验证了靶向宿主细胞的DHODH抑制剂能够通过抑制病毒复制和调节免疫两种途径发挥广谱抗病毒药效,还提示老药来氟米特或特立氟胺可能具有较好的抗新冠病毒的临床应用潜力,可满足目前新冠病毒肺炎临床急需。同时,新设计的候选药物S312和S416也有望开发成为抗RNA病毒的候选新药,为将来冠状病毒及其它RNA病毒的急性感染性疾病防控战做好了候选药物的储备。

目前,老药来氟米特已在武汉大学人民医院开展对新冠肺炎(COVID-19)的临床试验,该研究是一项针对中度、重症的病人的多中心、随机、双盲、对照性临床实验(临床注册号:ChiCTR2000030058)。前期的同情性用药结果表明,口服来氟米特的病人排毒时间(中位期5天)明显短于相同治疗条件下的对照病人(中位数11天),具有统计学的显着性差异p=0.046。同时,用药组病人反应急性炎症C反应蛋白水平明显下降,佐证了该药物的抗病毒、抗炎双效作用。此外,作为新概念抗新冠病毒药物,来氟米特于2020年5月29日获得全球医药创新领域知名公益科研机构英国生命爱科(LifeArc)的全额资助(150万英镑),用于与英方临床专家共同负责开展国际多中心临床试验研究(DEFEAT-COVID study),李洪林教授是该临床试验的发起人和首席科学家,目前已获得英国药品和保健品管理局(MHRA)的临床试验批文,开始在Ashford and St Peters Hospital招募COVID-19病人。

值得一提的是,中科院上海药物所蒋华良院士与许叶春研究员在同期Protein & Cell杂志上对该研究发表了Highlight文章Potential treatment of COVID-19 by inhibitors of human dihydroorotate dehydrogenase。

在该文章中,蒋院士提及和回顾了以Mpro、RdRp和S蛋白作为靶点的直接抗病毒药物(Direct-acting antiviral agents,DAA)的重要研究以及潜力。作为抗病毒的另一种策略,以宿主因子为靶点的抗病毒药物(Host-targeting antiviral, HTA)在耐药性以及广谱性上具有一定的优势,比如抗HIV药物Maraviroc就是一种HTA,靶标是CCR5。而在此项研究中,李洪林/徐可团队报道了一种针对SARS-CoV-2的HTA——DHODH(二氢乳清酸脱氢酶)抑制剂。

DHODH是催化嘧啶核苷酸从头合成途径第四步氧化还原反应的关键酶。抑制DHODH的活性,可抑制嘧啶碱基的从头合成,从而抑制快速增殖的淋巴细胞/肿瘤细胞或病毒的DNA和RNA的生物合成,起到抗自身免疫性疾病,抗癌和抗病毒的作用。

李洪林/徐可团队针对DHODH设计并获得了两种新抑制剂S312和S416,与已有DHODH抑制剂——来氟米特(Leflunomide)的活性代谢产物特立氟胺(Teriflunomide)一样,其对甲型流感(H1N1,H3N2,H9N2),Zika、Ebola病毒和SARS-CoV-2病毒都显示出了广谱抗病毒活性。尤其是针对SARS-CoV-2病毒,比瑞德西韦强45倍;比氯喹的活性强60余倍,是目前已报道的体外抑制活性最强的抗SARS-CoV-2候选化合物。另外,DHODH抑制剂S312与oseltamivir联用也显示出了可以降低动物模型中炎症因子水平的潜力。而SARS-CoV和SARS-CoV-2患者中也会出现炎症风暴,所以DHODH抑制剂在这一方面也具有潜力。

总之,这一工作揭示了DHODH可以作为一个极具吸引力的抗病毒靶点通过“两手抓”策略(抗病毒+免疫调节)实现广谱抗病毒的目的,为SARS-CoV-2和其它RNA病毒提供更多的治疗方案。S312和S416具有良好的成药性和药代动力学特点,可以作为候选HTA药物用于COVID-19治疗研究。目前DHODH的抑制剂来氟米特治疗COVID-19的临床试验已经在英格兰开展,并由LifeArc发起。

原始出处:

Rui Xiong, Leike Zhang, Shiliang Li, et al.Novel and potent inhibitors targeting DHODH are broad-spectrum antivirals against RNA viruses including newly-emerged coronavirus SARS-CoV-2.Protein Cell. 2020 Aug 4;1-17. doi: 10.1007/s13238-020-00768-w.

作者:佚名 来源:BioArt
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