IVD前沿丨短和长引物的混合物可显著提高检测基因效率

RNA分析是基因表达研究的一个重要方面，从基础研究到临床诊断都具有重要意义。绝大多数RNA分析的第一步是将RNA转录成cDNA。这个逆转录(RT)步骤具有重要意义，许多因素对RT的效率至关重要，如输入RNA的质量、引物策略、RT酶、缓冲液和反应条件。在引物方面，当目的是分析整个转录组时，广泛使用随机引物。随机引物最常用的引物是随机六聚体（6 mer）。然而，随机引物长度对RNA测序结果质量的影响尚不清楚。

近日，杂志Nature Communications上发表了一篇题为“Exploring the impact of primer length on efficient gene detection via high-throughput sequencing”的文章。在这里，作者比较了不同长度的随机引物在从人脑总RNA生成RNA-seq文库中的表现。令人惊讶的是，结果表明，随机6mer并没有产生最佳的整体性能。相反，随机18mer引物在检测大多数基因时更有效。特别是，可从人体组织样本中更有效地检测到较长的转录本，如蛋白质编码RNA和较长的非编码RNA，而较短的RNA的检测则不受强烈影响。

图片来源：Nature Communications

主要内容

引物长度对库复杂性的影响

为了测试不同长度的随机引物对RNA测序结果的影响，作者根据SMART-seq3文库制备流程制备了RNA测序文库。逆转录步骤中使用了6、12、18和24个核苷酸长度的随机引物。不同RT引物长度导致文库的大小分布没有明显差异。

在对文库进行Illumina测序后，作者发现，随机18mer引物检测到最多的基因(图A)和最多的转录本(图B)，尤其对于低表达基因检测效率高(FPKM 1 - 20，图C)，在高测序深度时更为明显(图D)。虽然可在所有引物中检测到大多数基因，但也检测到引物长度特异性基因。仅被6mer、24mer或12mer检测到的基因比例在4%到5%之间，而仅被18mer检测到的基因比例为10%。

不同长度的引物对检测到的基因进行定量。

图片来源：Nature Communications

检测到的基因的特性

接下来，作者分析了不同随机引物检测到的基因特征。18mer样品检测到的蛋白质编码基因数量最多，而12mer、24mer和6mer引物检测到的数量相似，其中6mer引物效率最低(图A)。同样，其他包含长基因的RNA生物型，如lncRNAs或假基因，用18mer引物检测效率最高。短RNA生物型(snRNA和snoRNAs)倾向于用较短的引物更好地检测。当基因根据转录物长度分类时，检测到的基因的长度依赖性分布更加明显(图C)。这表明，更有效地检测长基因可能是18mer基因检测效率更高的主要原因。

用不同长度的随机引物来鉴定所检测到的基因。

图片来源：Nature Communications

验证结果的可重复性

作者在更高的测序深度进行了第二次独立实验。与第一次测序结果相似，与其他引物相比，18mer对低表达基因的检测效率更高。每个生物型的检测基因分布和每个生物型的TPM与第一次实验相似，其中蛋白质编码基因所占比例最大。虽然与在较低测序深度下进行的初始实验相比，6mer、12mer和24mer引物之间的相对差异发生了变化，但第二次实验证实了使用18mer引物检测较长转录本的优势，而对于较短的生物型，6mer引物再次显示出优势（图E）。

高深度RNA测序后，用不同长度的引物对检测到的基因进行定量。图片来源：Nature Communications

不同RNA来源的RT效率

作者使用不同的RNA来源作为输入进行了额外的测序实验。从非洲绿猴细胞系Vero细胞中分离的RNA制备了测序文库。与前两次实验类似，随机6mer并没有表现出最高的基因检测效率。使用较长的随机引物有增强基因检测的趋势，但总体差异没有人脑实验中那么大。也可以观察到之前实验中引物长度与转录物长度之间的相关性，但程度较低。

作者使用了长度为50、80、150、300、500和1000 nt的人工RNA作为输入材料。再次发现随机6mer更容易生成较短的cDNA，而随机18mer更容易生成较长的cDNA。最后使用6mer和18mer引物的混合物进行了相同的实验。结果表明短和长引物的混合物增强了不同长度RNA的逆转录(图C、D)。综上所述，这些结果表明，在高通量RNA测序中，18mer RT引物比常用的6mer引物更能有效地检测长转录本(特别是> 1000 bp)。

短和长引物的混合物增强了不同长度RNA的逆转录。

图片来源：Nature Communications

总结与讨论

作者研究了不同长度的随机引物对逆转录效率的影响。发现随机的18mer引物在检测不同的转录本时最有效，特别是在构成文库很大比例的较长的生物型(>1000 nt)中，可能是由于引物与目标物之间的氢键数量增加。因此，从实用的角度来看，将随机的6mer替换为18mer，或将18mer添加到6mer中，都是提高转录组学研究文库复杂性的简单实现。此外，这是一种非常经济有效的方法，因为额外的成本限于较长的随机引物的成本，与随机6mer相比约高出33%，与RNA-seq的总成本相比可以忽略不计。且不需要额外的步骤或试剂来实施。

此外，重要的是要考虑到观察到的效果可能是特定于方案的。此研究采用了SMART-seq3方案，有助于减少随机引物的二级结构。18mer引物可能从这种优化中获益，因为与短引物相比，它们在更高的温度下仍然可以更有效地与模板RNA结合。在这种情况下，值得注意的是，随机引物具有25个核苷酸长的5 'adapter，可能对反应动力学有额外的影响。

总之，此研究强调了使用随机的18mer引物在检测广泛的转录本，特别是较长的转录本(>1000 nt)方面是最有效的。这些发现表明，引物长度在逆转录效率中起着重要作用，并强调了诸如RNA-seq等无偏方法对于全面评估引物策略的重要性。