寡核苷酸设计方法开发人员指南

生命是蛋白质与蛋白质相互作用的动态过程，因此要了解健康和疾病中的生命，需要的方法不仅要监测蛋白质的水平，还要考虑它们与哪些蛋白质相互作用。这一点尤其重要，因为蛋白质会随着相互作用伙伴的变化而改变其功能。蛋白质的存在并不能提供有关其功能状态（即活性或非活性）的信息，也不能提供有关其当前执行哪种功能的信息。随着基因组学和蛋白质组学方法的发展，我们意识到基因组的结构和蛋白质的存在。尽管仍有很多未知数，但我们对遗传畸变如何导致疾病以及这些畸变如何传播到蛋白质组中已经有了粗略的了解。由于单个细胞受到基因组的表观遗传调控和来自其微环境的外部信号以及细胞内的信号网络拓扑的控制。分析最好在单细胞水平上进行，如果可能的话，还保留其周围环境的信息。为了研究细胞通讯和信号转导，我们在过去二十年中一直在开发方法来可视化单个细胞中蛋白质相互作用的水平就地。这些方法的共同主题是，它们针对两种感兴趣的蛋白质，确定这些蛋白质是否非常接近，然后生成信号，以便通过显微镜观察相互作用事件。我们的目标是检查细胞和组织切片中的内源蛋白质-蛋白质相互作用。为了实现这一目标，我们依靠抗体来靶向感兴趣的蛋白质。为了确定与目标蛋白结合的一对抗体是否非常接近，我们使用与抗体缀合的短 DNA 寡核苷酸（邻近探针）来设置抗体之间距离的上限。双链 DNA 分子中两个相邻核苷酸之间的距离为 0.34 nm，因此附着的寡核苷酸可以跨越的距离取决于它们包含的核苷酸数量。我们设计的方法是为了利用单链 DNA 分子之间可预测的杂交。然后，两个邻近探针的近端结合将能够实现所连接的寡核苷酸之间的杂交或与随后添加的DNA寡核苷酸的模板杂交。然后可以对杂交的 DNA 寡核苷酸进行修饰、通过连接连接或通过 DNA 修饰酶切割，以产生作为邻近事件报告者的 DNA 分子。该方法的最后一步是利用由一对邻近探针的近端结合形成的 DNA 分子，产生强烈的荧光信号，可以通过标准显微镜轻松检测到。为了实现这一目标，我们利用了两种技术：(1) 滚环扩增 (RCA)，

在本文中，我们将深入描述这些方法的设计、它们的优点和局限性，以及它们使用和解释数据的注意事项。